稳定表达野生型PINK1蛋白SH-SY5Y细胞株的建立

目的 构建常染色体隐性遗传早发性帕金森综合征(AREP)PINK1基因真核表达载体,建立稳定表达PINK1蛋白的人神经母细胞瘤(SH-SY5Y)细胞株.方法 采用聚合酶链反应(PCR)方法,以人胎脑cDNA文库为模板扩增PINK1基因全长cDNA编码区序列,重组DNA技术定向插入真核表达质粒pcDNA3.1-myc-his(-)B,经酶切和测序鉴定后,用脂质体转染SH-SY5Y细胞,通过G418筛选,挑选出稳定转染的单克隆株,经提取gDNA进行PCR扩增、反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及Western blot 法检测PINK1基因在DNA、mRNA水平及蛋白水平的表达.结果 成功构建了PINK1-pcDNA3.1-myc-his-(-)B真核表达载体,稳定转染SH-SY5Y细胞后,经提取gDNA扩增、RT-PCR及Western blot检测到了野生型PINK1基因在基因组的整合、转录和蛋白水平表达.结论 构建了PINK1基因真核表达载体和稳定表达PINK1蛋白的SH-SY5Y细胞株,为进一步研究PINK1基因功能及AREP发病机制提供了一个转基因细胞模型.

PINK1基因突变增强帕金森病相关毒物神经毒性作用的线粒体机制

目的:研究PINK1基因突变对帕金森病相关毒物对于神经元线粒体功能的影响.方法:用N27细胞系构建可稳定表达PINK1-L347p突变基因的可诱导型细胞系,Western Blot方法测定PINK1-L347p的表达.Image J软件测定稳定表达PINK1-L347p突变基因的N27细胞内线粒体的长宽比和圆形度.MTT比色法检测不同浓度的1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)或百草枯(PQ)对空质粒对照组(EV组)和稳定表达PINK1-L347p组(L347p组)细胞存活率的影响.结果:流式细胞术和Western Blot验证了PINK1-L347p突变基因稳定表达的N27细胞系构建成功.L347p组的线粒体形态明显过度断裂,与EV组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).与EV组比较,L347p组对MPP+或PQ的敏感性增强(P＜0.05);PINK1-L347p细胞系中诱导剂ponA干预组细胞死亡率明显高于无诱导剂PonA干预组(P＜0.05).结论:PINK1突变可导致线粒体形态学改变和功能异常,PINK1-L347p突变可增加哺乳动物多巴胺神经元对于MPP+和PQ的敏感性,更易导致细胞死亡.

PINK1/Parkin-directed mitophagy pathway: A mechanistic linkage in Parkinson' s Disease

早发性帕金森综合征的PINK1基因变异分析

目的:探讨中国大陆汉族早发性帕金森综合征(early-onset Parkinsonism,EOP)患者PTEN诱导激酶1(PTEN-induced kinase 1,PINK1)基因突变特点.方法:在149例汉族EOP患者中应用DNA直接测序技术(DNA sequencing)检测PINK1基因点突变及小的插入/缺失,应用实时荧光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)技术检测PINK1基因大片段插入/缺失及重排突变.结果:在本组EOP患者中共发现5例患者存在4个突变,包括3个点突变c.832C>G,c.938C>T和c.1 220G>A,1个第3～8号外显子杂合缺失,其中c.832C>G为新突变;14个已知多态位点,1个新多态位点c.899+18G>A.对多态位点c.189C>T的卡方检验显示EOP组与正常对照组差异有统计学意义(基因型χ2=21.244,P<0.0001;T等位基因χ2=24.353,P<0.0001),对多态位点c.960-5G﹥A的卡方检验显示EOP组与正常对照组差异有统计学意义(基因型χ2=6.524,P=0.038;A等位基因χ2=6.725,P=0.0095).结论:中国大陆汉族EOP患者中存在PINK1基因点突变以及外显子重排突变,本组EOP患者PINK1基因突变率为3.35%,多态位点c.189C>T与c.960-5G>A为中国大陆EOP患者易感因素.

线粒体自噬在百草枯中毒大鼠模型肺纤维化中的作用研究

目的:建立百草枯(paraquat,PQ)中毒大鼠模型,观察不同阶段肺线粒体膜电位(JC-1染色)、调控线粒体自噬关键性蛋白PINK1、Parkin及活性氧(reactive oxygen species,ROS)的变化,探讨线粒体自噬是否参与PQ中毒肺纤维化的发生.方法:成年雄性SD大鼠42只,随机分为正常对照组(n=6)、模型组(n=36),模型组下设2 h、12 h、1 d、3 d、7 d和14 d共6个时间点,每个时间点各6只大鼠.使用20%PQ溶液50 mg/kg一次性灌胃大鼠建立PQ中毒模型.通过流式细胞仪检测血红细胞ROS浓度;HE染色和Masson染色观察PQ中毒后肺组织病理损害;JC-1染色检测肺组织线粒体膜电位变化;Western blot检测PINK1、Parkin蛋白变化.结果:与对照组相比,随着PQ中毒时间的延长,肺纤维化病理评分较对照组升高,差异有统计学意义(P<0.05);PQ组ROS荧光阳性强度率比值在中毒后2 h显著升高,中毒后12 h达高峰后逐渐下降(P<0.05),中毒后14 d与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05);PQ组肺组织JC-1红绿荧光比均较对照组降低,Western blot提示随中毒时间延长,PINK1及Parkin蛋白表达均升高,差异有统计学意义(P<0.01).PQ组肺组织JC-1红绿荧光比与PINK1及Parkin、肺纤维化病理评分均呈负相关(r=-0.890,P<0.01;r=-0.845, P<0.01;r=-0.794,P<0.01).在PQ中毒12 h内,血红细胞ROS荧光强度阳性率与JC-1红绿荧光比呈负相关(r=-0.712,P<0.01),与PINK1及Parkin、肺纤维化病理评分呈正相关(r=0.571,P<0.01;r=0.484,P<0.01;r=0.602,P<0.05).结论:PQ中毒导致大鼠产生了明显氧化应激,诱发了线粒体自噬.ROS的产生与线粒体自噬的发生密切相关,共同参与了PQ大鼠肺纤维化的发生发展.

帕金森氏病相关蛋白Pink1促进自噬的研究

目的 探讨帕金森氏病相关蛋白Pink1在自噬过程的作用.方法 采用RT-PCR扩增基因片段,构建Pink1、自噬抑制蛋白Bcl-XL和自噬激活因子Beclin1等重组质粒,并通过慢病毒系统建立稳定表达Pink1-Flag的HEK293细胞株,通过重组质粒转染细胞,过表达相关蛋白,用免疫共沉淀和Western blot检测Pink1和Bcl-XL的相互作用,Pink1对Bcl-XL和Beclin1相互作用的影响,以及Pink1对自噬的影响.结果 自噬抑制蛋白Bcl-XL与Pink1有相互作用,过量表达Pink1可以抑制Bcl-XL与自噬激活因子Beclin1的相互作用.过量表达Pink1提高自噬下游蛋白LC3Ⅱ/LC3 Ⅰ.结论 帕金森氏病相关蛋白Pink1通过与自噬抑制蛋白Bcl-XL相互作用释放自噬促进因子Beclin1来激活自噬.

PINK1蛋白在线粒体外膜上的定位机制研究

目的 研究帕金森氏病相关蛋白PINK1在线粒体外膜上定位的具体机制.方法 以体外培养的HEK293T细胞转染表达不同蛋白的真核表达质粒,然后加入DMSO作为对照或者加入线粒体解偶联剂CCCP,以Western印迹和免疫共沉淀技术来检测蛋白的表达和相互作用的变化.结果 全长的PINK1在CCCP作用下和线粒体上的Tom40的相互作用能力是DMSO对照的20倍以上,而去掉线粒体定位序列(MTS)和跨膜序列(TM)的PINK1以及其它线粒体外膜蛋白在CCCP作用下没有这样的相互作用.当CCCP去掉后,PINK1全长和Tom40的相互作用迅速减弱.去掉或突变掉TM序列的PINK1和Tom40不论在CCCP是否存在的情况下,均有相互作用.结论 在受损线粒体外膜积累的PINK1只是卡在外膜蛋白转运通道上,并没有真正转运到外膜上.而当线粒体的跨膜电位恢复时,它会继续向内转运.

环孢素A对百草枯中毒大鼠线粒体自噬导致的肺纤维化作用研究

目的 建立百草枯(PQ)中毒大鼠模型,探讨环孢素A(CsA)对PQ中毒大鼠肺线粒体自噬的作用及机制.方法 成年雄性SD大鼠54只,随机分为正常对照组(n=12)、PQ组(n=24),CsA大、中、小剂量组(n=18).PQ组下设1天、3天、7天和14天4个时间点,每个时间点每个剂量组各6只大鼠.使用20％PQ溶液50 mg/kg一次性灌胃建立大鼠PQ中毒模型,并以自噬发生明显的时间点作为CsA干预时间点.各CsA干预组在给予20％PQ溶液灌胃的前3天开始分别予环孢素5 mg/(kg·d)、10 mg/(kg·d)、15 mg/(kg·d)灌胃.通过Masson染色现察PQ中毒后肺组织病理损害,JC-1染色检测肺组织线粒体膜电位变化,Western blot检测调控线粒体自噬关键性蛋白PINK1、Parkin的水平变化.结果 与正常对照组相比,随着PQ中毒时间的延长,PQ中毒大鼠肺纤维化病理评分升高,肺组织JC-1红绿荧光比降低,PINK1及Parkin蛋白表达均升高,差异有统计学意义(P＜0.01).与PQ组比较,环孢素A组大鼠肺组织肺纤维化病理评分、PINK1及Parkin蛋白均下降,差异有统计学意义(P＜0.05),JC-1红绿荧光比升高,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 环孢素A可通过影响PINK1/Parkin蛋白,减轻百草枯中毒引起的线粒体自噬,改善肺纤维化.

脂多糖诱导脓毒症小鼠心肌细胞及线粒体自噬

目的 探讨脓毒症心肌损伤时心肌细胞及线粒体自噬水平的变化.方法 雄性C57BL/J小鼠随机分为空白对照组(NC)、LPS处理6、12、24、36 h组.LPS处理组小鼠腹腔注射10 mg/kg LPS建立脓毒症模型,空白对照组注射等量生理盐水.分别于以上时间点处死小鼠,收集血液及心脏组织,提取心肌组织胞质蛋白、线粒体及线粒体蛋白,另取心肌组织进行冰冻切片;应用ELISA试剂盒测定血清心肌肌钙蛋白Ⅰ(cTnⅠ)含量变化;JC-1染色结合荧光酶标仪检测LPS刺激后不同时间点线粒体膜电位变化;Westem blot法检测自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3)、PTEN诱导激酶1(pink1)、E3泛素连接酶帕金森病蛋白(parkin)水平;免疫荧光组织化学染色检测心肌组织LC3、pink1/parkin蛋白的定位及其在不同处理组的表达差异.结果 与对照组相比,LPS诱导的脓毒症小鼠血清cTnⅠ在6h即开始明显升高;LPS处理组线粒体膜电位下降,在LPS 12 h组低;细胞自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ在腹腔注射LPS 12 h明显升高,然后逐渐下降;pink1/parkin在腹腔注射LPS6h明显升高,然后逐渐下降.结论 脓毒症心肌损伤时心肌细胞及线粒体自噬水平升高,自噬应激可能更早发于心肌线粒体.

PINK1在黏液性上皮性卵巢肿瘤中表达的研究

目的:探讨线粒体蛋白PINK1在黏液性上皮性卵巢肿瘤中的表达规律及其与临床病理参数的关系.方法:应用免疫组化SP法检测58例黏液性上皮性卵巢肿瘤及15例正常卵巢石蜡标本中PINK1的表达情况,并分析其表达与分期、分化程度及淋巴结转移的相关性.结果:在恶性及交界性黏液性上皮性卵巢肿瘤中,PINK1的阳性表达率分别为96.43%,62.5%,有统计学差异.且均明显高于良性黏液性上皮性卵巢肿瘤组(14.29%)和正常卵巢组(13.33%).采用Kruskal-Wallis H Test比较四组间PINK1表达强度,P＜0.0001,提示差异具有统计学意义.PINK1的表达强度在不同分期、不同分化程度及不同淋巴结转移情况的各组之间比较,差异均无统计学意义,P值分别为0.243、0.483、0.144.结论:PINK1与恶性黏液性上皮性卵巢肿瘤的发生相关,与分期、分化及淋巴结转移等临床病理参数无关.

黑素细胞中PINK1的表达及在氧化损伤中的作用

目的 明确正常人黑素细胞PIG1中PINK1的表达,探讨PINK1在黑素细胞氧化损伤中的作用.方法 ①采用逆转录实时定量PCR(RT-qPCR)及免疫印迹法(WB),检测PIG1黑素细胞中PINK1的mRNA及蛋白的表达水平;②不同浓度 H202处理PIG1细胞24h, CCK-8法测定细胞增殖活力,确定H2O2适浓度;③设计并合成3对PINK1干扰片段(siRNA)转染PIG1细胞,采用RT-qPCR法筛选干扰效率高的siRNA;④实验分组:对照组、Mock组、NC组、转染组.细胞转染48 h后,再加入H2O2处理24h,观察各组细胞形态,CCK-8法测定细胞增殖活力.结果 ①在PIG1黑素细胞中检测到PINK1 mRNA及蛋白的表达;②黑素细胞增殖活力呈H2O2浓度依赖性降低,0.6mmol/L H2O2组降低至(49.02 ±2.40)％,接近IC50,故以此浓度作用24h建立氧化损伤模型;③与Mock组相比,PINKl-siR-NA3转染48h干扰效率高(＞90％ );④与对照组相比,PINK1-siRNA3转染组树突回缩及变圆悬浮的细胞明显增多,转染组细胞增殖活力明显降低(P ＜0.01) .结论 本研究首次明确了 PINK1在正常人黑素细胞中的表达,下调PINK1可加重 H202所致的黑素细胞形态学改变及活力降低,表明PINK1对黑素细胞具有一定的保护性作用.

PINK1/Parkin通路在脊髓脉冲射频治疗大鼠带状疱疹后神经痛中的作用

目的 探讨PINK 1/Parkin信号通路在脉冲射频(PRF)治疗大鼠带状疱疹后神经痛(PHN)模型中的作用.方法 SPF级健康成年雄性SD大鼠32只,体重200～220 g,按照随机数字表法将其随机分为溶剂对照组(V-C组)、模型对照组(RTX-C组)、假治疗组(RTX-Sham组)和治疗组(RTX-PRF组),每组8只.于制模前2h,制模后1、4、7、10、14d,PRF治疗后1、4、7、10、14、21、28、35 d时分别测定4组大鼠机械痛阈值(PMWT).治疗后第35日处死4组大鼠,取L4-6脊髓组织.采用蛋白印迹技术检测脊髓组织蛋白PINK1和Parkin的表达水平.结果 与V-C组比较,树脂毒素(RTX)处理后RTX-C组、RTX-Sham组及RTX-PRF组大鼠的PMWT明显降低(P＜0.05);与RTX-C组比较,PRF治疗后RTX-PRF组大鼠的PMWT明显升高(P＜0.05);与V-C组比较,RTX处理后RTX-PRF组大鼠脊髓组织蛋白PINK1和Parkin表达上调(P＜0.05);与RTX-C组比较,PRF治疗后RTX-PRF组大鼠脊髓组织蛋白PINK1和Parkin表达降低(P＜0.05).结论 PRF可通过抑制脊髓组织PINK 1/Parkin通路活性对PHN模型大鼠产生良好的镇痛作用.