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互补于hTERT关键区段的反义RNA抑制肝癌细胞
目的研究针对人类端粒酶催化亚单位(hTERT)调控区C-MYC结合位点的反义RNA抑制肝癌细胞生长.方法细菌内同源重组构建反义RNA腺病毒(rAd-asmycb),转染HepG2.2.15肝癌细胞,流式细胞术检测细胞凋亡,透射电镜下观察凋亡细胞形态,聚合酶链反应-酶联免疫分析(PCR-ELISA)、逆转录-PCR(RT-PCR)分别检测细胞端粒酶活性及mRNA水平上hTERT表达.结果反义RNA抑制肝癌细胞生长,细胞凋亡率为40.7%,显示特征性凋亡细胞形态,能够显著降低细胞端粒酶活性,在mRNA水平上抑制hTERT表达.结论hTERT调控区C-MYC结合位点可能是肝癌基因治疗的有效靶位.
关键词： 人类端粒酶催化亚单位 C-MYC结合位点 肝细胞癌 基因治疗 -
小RNA干扰对氟他胺耐受性前列腺癌细胞LNCaP端粒酶活性的影响机制研究
目的 探讨hTERT基因的两端各三个碱基硫代修饰反义寡核苷酸(AS PS-ODN)对氟他胺耐受性前列腺癌细胞LNCaP端粒酶活性的影响机制.方法 采用TRAP-PCR-ELISA法检测氟他胺耐受性前列腺癌细胞的端粒酶活性;采用RT-PCR方法检测hTERT基因mRNA的表达水平;以免疫组化通过流式细胞仪检测hTERT基因蛋白水平的变化.结果 hTERT基因的两端各三个碱基硫代修饰反义寡核苷酸(AS PS-ODN)作用于LNCaP细胞48h,其端粒酶活性下降,作用72h,其端粒酶活性受到抑制.结论 通过hTERT基因的两端各三个碱基硫代修饰反义寡核苷酸(AS PS-ODN)特异性抑制hTERT基因mRNA的表达降低氟他胺耐受性前列腺癌细胞LNCaP端粒酶活性,为氟他胺耐受性前列腺肿瘤的基因治疗提供新思路.
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靶向于端粒酶调控区反义RNA腺病毒的构建
目的:构建靶向于人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)调控区的反义RNA腺病毒.方法:PCR扩增hTERT调控区1 779 bp的DNA片段,与腺病毒穿梭载体pShuttleCMV连接,PCR筛选反向插入的hTERT反义腺病毒穿梭载体pCMV-ashTERT,将pCMV-ashTERT与骨架质粒pAdEasy-1共转染受体菌BJ5 183,进行同源重组.用含卡那霉素的LB平板筛选同源重组阳性的克隆,酶切鉴定后,以Pac Ⅰ酶切线性化,转染包装细胞HEK293,在显微镜下观察细胞形态以鉴定重组的腺病毒,并以空斑形成实验测定重组病毒的滴度.结果:成功构建了端粒酶催化亚单位调控区的反义RNA重组腺病毒(pAd咀shTERT),滴度为2.8×1011pfu/ml.结论:成功构建hTERT调控区反义腺病毒,为探讨以端粒酶为靶点的抗肿瘤药物奠定了基础.
关键词： 人类端粒酶催化亚单位 腺病毒载体 RNA 反义 同源重组 -
PCR-ELISA定量检测as-hTERT对HepG2.2.15细胞端粒酶活性的抑制作用
目的:采用PCR-ELISA方法探讨人类端粒酶催化亚单位(hTERT)基因关键区段的反义寡核苷酸(as-hTERT)对HepG2.2.15细胞端粒酶活性的抑制作用.方法:通过PCR合成as-hTERT及无关对照序列,体外作用于HBV DNA转染的HepG2.2.15细胞,用PCR-ELISA定量检测反义核酸作用后的端粒酶活性,MTT法观察as-hTERT对细胞生长的抑制作用,ELISA法检测as-hTERT对HBsAg和HBeAg 表达的影响.结果:as-hTERT作用浓度为10 μmol/L时,定量检测端粒酶活性,A450 nm值为0.42,低于无关序列与生理盐水对照的A450 nm值(分别为1.46、1.49),as-hTERT可抑制细胞生长,对HBsAg和HBeAg的佳抑制率分别为76%和56%.结论:as-hTERT在体外可明显降低HepG2.2.15细胞的端粒酶活性,抑制细胞的生长,并可影响HBV抗原表达.
关键词： 人类端粒酶催化亚单位 寡核苷酸类 反义 聚合酶链反应-酶联免疫分析 -
急性溶血性贫血患儿人类骨髓端粒酶催化亚单位的表达
目的 探讨急性溶血性贫血患儿人类骨髓端粒酶催化亚单位(hTERT)的表达及其与外周静脉血Hb水平的关系.方法 急性溶血性贫血患儿15例.男13例,女2例;年龄5.5～11.0岁.其中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G-6-PD)缺乏症患儿10例;药物诱导性溶血性贫血患儿5例.选择同期本院血液/肿瘤科病房确诊为上呼吸道感染所致的粒细胞减少症、骨髓检查正常患儿10例为对照组;4株K562细胞为阳性对照.采集G-6-PD缺乏症、药物诱导性溶血性贫血和粒细胞减少症患儿外周静脉血,全自动血液分析仪XE2100检测各组患儿外周静脉血Hb水平,采用Zinkham法检测G-6-PD缺乏症和对照组患儿血G-6-PD活性,分析二组患儿血G-6-PD活性的差别.采集急性溶血性贫血组和对照组患儿胸骨骨髓,采用半定量反转录-聚合酶链反应检测其骨髓和阳性对照K562细胞株的hTERT的相对表达水平,比较急性溶血性贫血组与对照组患儿、阳性对照K562细胞株hTERT相对表达水平的差异.常规检测急性溶血性贫血患儿外周血Hb水平.采用Pearson直线相关分析急性溶血性贫血患儿骨髓hTERT表达水平与外周血Hb水平的关系.结果 与对照组比较,G-6-PD缺乏症患儿血G-6-PD活性明显下降(t=8.373 P=0).急性溶血性贫血患儿骨髓hTERT相对表达水平显著高于对照组患儿(t=6.052 P=0),但明显低于K562细胞株(t=9.893 P=0).急性溶血性贫血患儿骨髓hTERT表达水平与其外周血Hb水平呈负相关(r=-0.888 P=0).结论 急性溶血性贫血患儿急性溶血时,低水平Hb可在一定范围内上调骨髓hTERT表达水平.
关键词： 急性溶血性贫血 人类端粒酶催化亚单位 端粒酶 -
重型β-珠蛋白生成障碍性贫血患儿hTERT基因表达的研究
目的 骨髓人类端粒酶催化亚单位(hTERT)是控制人细胞端粒酶活性的限速成分,决定了细胞寿命.该研究初步探讨重型β-珠蛋白生成障碍性贫血hTERT表达的变化及其与外周血红蛋白水平的关系.方法 多重等位基因特异聚合酶链反应(MASPCR)分析重型β-珠蛋白生成障碍性贫血患儿的基因类型,半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测重型β-珠蛋白生成障碍性贫血和粒细胞减少症患儿骨髓和阳性对照K562细胞株的hTERT相对表达水平,常规检测患儿外周血血红蛋白水平.Spearman直线相关分析hTERT表达与外周血血红蛋白水平的关系.结果 重型β-珠蛋白生成障碍性贫血患儿组骨髓hTERT相对表达水平高于粒细胞减少症患儿组(0.2928±0.0838 vs 0.0993±0.0336,P<0.01),但明显低于K562细胞株(0.8291 ±0.0908,P<0.01).重型β-珠蛋白生成障碍性贫血患儿组骨髓hTERT表达与其外周血血红蛋白水平呈负相关(r=-0.841,P<0.01).结论 重型β-珠蛋白生成障碍性贫血患儿慢性溶血时,低水平血红蛋白可能在一定范围内上调骨髓hTERT基因表达水平.
关键词： β-珠蛋白生成障碍性贫血 人类端粒酶催化亚单位 突变 儿童 -
端粒酶基因反义核酸下调HL-60细胞端粒酶活性的研究
背景与目的:人类端粒酶催化亚单位 (human telomerase reverse transcriptase, hTERT)基因是端粒酶活化唯一的限制性组分 . 在细胞永生化过程中 , hTERT表达的调控是一个关键性的靶目标 . 端粒酶 RNA的反义核酸可以抑制端粒酶的活性及肿瘤细胞的生长 . 本研究观察 hTERT基因的全硫代修饰反义寡核苷酸 ( antisense phosphorothioate oligodeoxynucleotide,ASODN) 对 HL-60细胞端粒酶活性的影响 . 方法 : 采用端粒重复序列扩增法检测白血病细胞的端粒酶活性 ; 采用逆转录 -聚合酶链反应方法检测 hTERT基因 mRNA的表达水平 ; 以间接免疫荧光标记法通过流式细胞仪检测 hTERT蛋白表达含量的变化 . 结果 : hTERT基因 ASODN作用于 HL-60细胞后 , hTERT mRNA 表达水平及蛋白表达水平均明显降低 , 分别与正义寡核苷酸组、空白对照组相比有显著性差异 ( P< 0.05) . 同时 hTERT基因 ASODN作用于 HL-60细胞 48 h, 其端粒酶活性明显降低 ; 作用 72 h, 端粒酶活性明显受到抑制 . 结论 : 通过 hTERT基因反义寡核苷酸特异性地抑制 hTERT基因的表达可下调 HL-60细胞的端粒酶活性 .
关键词： 人类端粒酶催化亚单位 反义寡核苷酸 端粒酶 HL-60细胞 -
端粒酶hTERT基因反义核酸对膀胱癌细胞T24端粒酶活性的影响
目的 探讨hTERT基因的全硫代修饰反义寡核苷酸(AS PS-ODN)对膀胱癌细胞T24端粒酶活性的影响.方法 采用TRAP-PCR-ELISA法检测膀胱癌细胞的端粒酶活性;采用RT-PCR方法检测hTERT基因mRNA的表达水平;以免疫组化通过流式细胞仪检测hTERT基因蛋白水平的变化.结果 hTERT基因的全硫代修饰反义寡核苷酸(ASPS-ODN)作用于T24细胞48h,其端粒酶活性下降,作用72h,其端粒酶活性受到抑制.结论 通过hTERT基因的全硫代修饰反义寡核苷酸(ASPS-ODN)特异性抑制hTERT基因mRNA的表达降低膀胱癌细胞T24端粒酶活性.
关键词： 端粒酶 反义寡核苷酸 人类端粒酶催化亚单位 T24细胞 -
端粒酶hTERT基因反义核酸对肿瘤坏死因子-α诱导膀胱癌T24细胞凋亡的影响
目的 探讨人类端粒酶反转录酶催化亚单位(hTERT)基因的全硫代修饰反义寡核苷酸抑制膀胱癌T24细胞端粒酶活性后,肿瘤坏死因子-α(TNF-α)对膀胱癌T24细胞凋亡的增敏作用.方法 采用端粒重复序列扩增多聚酶链反应-酶联免疫吸附测定法检测膀胱癌细胞的端粒酶活性;采用噻唑蓝比色试验观察hTERT基因的全硫代修饰反义寡核苷酸与TNF-α共同作用对膀胱癌T24细胞生长活力的影响;通过流式细胞仪测定凋亡细胞的百分率.结果 hTERT基因的全硫代修饰反义寡核苷酸作用于膀胱癌T24细胞48 h,其端粒酶活性下降;作用72 h,其端粒酶活性受到抑制,与反义核酸组、空白对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05).hTERT基因的全硫代修饰反义寡核苷酸作用于膀胱癌T24细胞后,加入TNF-α作用48 h,T24细胞的抑制率为39％,与对照组、正义核酸组、全硫代修饰反义寡核苷酸组、TNF-α组及正义核酸+TNF-α组相比,差异有统计学意义(P＜0.05).hTERT基因的全硫代修饰反义寡核苷酸作用于膀胱癌T24细胞后加入4 μg/mL TNF-α作用48 h,凋亡细胞的百分率为35.18％;与对照组、正义核酸组、全硫代修饰反义寡核苷酸组、TNF-α组及正义核酸+TNF-α组相比,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 通过hTERT基因的全硫代修饰反义寡核苷酸能降低膀胱癌T24细胞端粒酶活性;对TNF-α诱导膀胱癌T24细胞凋亡有增敏作用.
