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A型禽流感病毒M2e重组T7噬菌体疫苗构建及免疫原性研究
构建展示A型禽流感病毒M2e多肽的重组T7噬菌体,检测其对SPF鸡的免疫保护效果.比对GenBank近期发表的A型禽流感病毒M2e基因序列进行人工合成并重复至两拷贝,将其克隆到T7 Select 415-1b噬菌体多克隆位点,构建重组噬菌体T7-M2e.经PCR鉴定并序列测定筛选阳性重组噬菌体,SDS-PAGE和Westernblot检测重组噬菌体表面M2e多肽.重组噬菌体以1×1010pfu/只剂量免疫SPF鸡,免疫后不同时间段采血通过ELSIA检测血清中抗M2e抗体,免疫荧光检测血清抗体与H9亚型禽流感病毒的结合能力,并以200个EID50/只剂量进行攻毒保护效率检测.成功构建重组噬菌体T7-M2e,插入两拷贝M2e基因获得表面展示,并与M2e抗体有免疫反应活性.噬菌体疫苗免疫后均产生抗M2e抗体,其抗血清能跟病毒粒子特异性结合,攻毒保护率达4/5(80％).获得了展示禽流感病毒M2e多肽的重组噬菌体,噬菌体疫苗免疫鸡产生较高血清抗体并提供攻毒保护,为新型通用禽流感疫苗研制提供新思路.
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甲型流感H1N1(2009)流感病毒M2e单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA检测方法的建立
目的 制备甲型流感H1N1(2009)流感病毒M2e单克隆抗体,并建立检测M2e的双抗体夹心ELISA方法.方法 采用碳化二亚胺法将人工合成的M2e多肽分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)进行偶联后作为免疫原,利用杂交瘤细胞技术制备抗A型流感M2e单克隆抗体并进行抗体的鉴定,建立检测M2E的双抗体夹心ELISA方法.结果 制备了3株甲型流感H1N1(2009)流感病毒M2e单克隆抗体,经鉴定单克隆抗体均为IGg1a亚型.利用制备的M2e单克隆抗体建立和优化甲型流感M2e检测双抗体夹心ELISA方法,特异性符合临床要求,灵敏度为19 ng/ml.结论 制备了甲型流感H1N1(2009)M2e单克隆抗体,建立的M2e检测双抗体夹心ELISA方法具有较高的灵敏度和特异性,为研究M2e单克隆抗体作用机制奠定了基础.
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流感通用疫苗的研究进展
流感是一种呼吸道传染性疾病.目前制备流感疫苗主要利用流感病毒的HA和NA诱导相应的抗体,但存在抗原漂移和抗原转换等问题.解决办法之一就是研制流感通用疫苗.M2e是流感病毒M2蛋白的胞外区,它的序列相对保守.利用HBc作为病毒样颗粒包装M2e是至今为止制备流感通用疫苗可行的方法.实验证明,M2e-HBc融合蛋白不仅能诱导出足够的抗体,还能增强T细胞反应,产生交叉性保护效应,大大降低流感病毒的致病率、致死率,促进疾病的恢复.此外,还有流感病毒的NP和HA等保守序列,结合佐剂及黏膜给药方式都不失为通用疫苗的可行选择.
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局灶性癫痫继发性强直—阵挛阶段中非对称性强直的临床特征
目的 分析局灶性癫痫继发强直-阵挛阶段非对称性强直的临床症状学特点.方法 28例患者54次非对称性强直发作,观察两种非对称性强直姿势—M2e和(或)"4"字征,分析其定侧意义、时间相关性及演变特点.结果 ①100%(33/33)M2e出现在致痫区对侧,56%(19/34)"4"字征伸直侧位于致痫灶对侧;② 定侧正确与错误的"4"字征出现时间及持续时间比较(30.3s vs 50.6s,4.6s vs 15.7s),后者差异具有显著性;③M2e转变为定侧正确与定侧错误"4"字征的时间分别为7.5s和15.4s,差异具有显著性.结论 局灶性癫痫中M2e具有定侧意义,而"4"字征在颞叶癫痫中具有较好的定侧价值.
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甲型流感病毒M2e与人血清白蛋白融合蛋白在毕赤酵母中的分泌表达
目的 将甲型流感病毒M2蛋白胞外区(M2e)基因与人血清白蛋白(HSA)基因融合,以构建高效分泌表达的毕赤酵母菌株.方法 通过RT-PCR扩增HSA基因,构建pPICZα-HSA质粒,将人工合成的M2e序列与pPICZα-HSA质粒分别经BstBI 和KpnI 酶切消化后连接,构建真核表达载体pPICZα-HSA/M2e,线性化后电转化毕赤酵母X-33.用PCR法筛选Zeocin抗性阳性的克隆,SDS-PAGE和Western印迹法筛选高表达HSA/M2e菌株.结果 经RT-PCR法克隆的HSA基因序列与GenBank登录的cDNA序列一致,构建的pPICZα-HSA/M2e真核表达载体,经电转化获得Zeocin抗性阳性的克隆.SDS-PAGE和Western印迹分析证实了甲醇诱导的培养基上清中含有HSA/M2e,分子量约为68 kD.结论 成功构建了分泌表达重组HSA/M2e融合蛋白的毕赤酵母菌株,为进一步研究其生物学活性奠定了基础.
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流感病毒膜蛋白M2e应用研究进展
流行性感冒是一种传染性较高的急性呼吸道疾病,极大地威胁了人类健康.由于流感病毒易发生变异,致目前的防治措施不能及时有效地应对,使防治效果严重降低.流感病毒膜蛋白M2e(extracellular domain of the M2 protein)高度保守,是流感病毒的通用性作用靶点,基于M2e的免疫预防措施可提供广谱的保护作用.M2e疫苗及M2e抗体已成功在动物模型中发挥抗流感作用,临床应用则报道较少,因而研究M2e对于流感病毒的防治具有重要意义.
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M2e通用流感疫苗的研究进展
M2基质蛋白是A型流感病毒膜蛋白,在A型流感病毒的生命周期中,M2具有重要的生物学功能,已成为抗病毒药物研究的靶蛋白.其胞外区M2e(M2 eetodomain,M2e)为24个氨基酸残基,该片段在多病毒株中具有极高的保守性.针对M2e产生IgG型抗体能够防止流感病毒引发的死亡,减少动物模型中流感的发病率.了解有关M2e疫苗的研究进展,以及关于M2e作为A型流感疫苗靶抗原的关键问题很重要.
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流感病毒表位疫苗的研究进展
流感是由流感病毒引起的高度传染性疾病.流感病毒分为甲、乙、丙3个型.其中甲型和乙型流感病毒导致了大多数人类感染病例,并造成全球流感季节性流行和大流行.现有流感疫苗的缺陷直接推进了新型流感疫苗的研制.通过适当表位设计的新型疫苗可以刺激机体产生特异性抗体和CTL,从而达到预防和治疗的目的 .这类疫苗对于多个流感毒株都有效.目前需要对这类疫苗作进一步研究,确定并解决具体使用中的一系列问题,使其达到好的免疫效果和适用范围,以应对流感这个全球性的健康威胁.
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A型流感病毒M2e单克隆抗体的研制及鉴定
目的 制备A型流感M2e(2-24)单克隆抗体,并进行初步研究.方法 以M2e-OVA免疫BALB/c小鼠,取免疫后的小鼠脾细胞和SP2/0细胞融合,经有限稀释法克隆化及筛选,获得抗M2e(2-24)的杂交瘤细胞株,制备腹水,并对其进行纯化,分析和鉴定.结果 获得3株稳定分泌M2e单克隆抗体的杂交瘤细胞株L1,L2,L3,其免疫球蛋白亚类均为IgG1,腹水效价为105以上. 结论 成功制备了抗M2e(2-24)的特异性单克隆抗体,为研制具有交叉保护作用的流感疫苗奠定了基础.
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顶叶病变导致类似额叶癫(癎)的非对称性强直发作(附1例报告)
在长程视频脑电监测中,患者临床表现为肢体的非对称性强直姿势发作,并且由"M2e"转变为"4"字征,类似于额叶癫(癎),头皮脑电图发作起始位于额叶,而头核磁共振(MRI)及正电子发射断层显像(PET)提示顶叶病灶,并经颅内电极证实,手术切除病灶,术后发作显著减少.现报道1例如下,并结合文献复习.
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甲型流感病毒M2e与CtB基因融合表达及其免疫特性初步研究
目的: 构建真核表达重组质粒pcDNA3.1a(+)-M2e/CtB, 并初步研究其在NIH3T3细胞中的表达特性及免疫特性.方法: 重叠PCR法扩增甲型流感病毒M2e基因和霍乱毒素CtB基因, 将扩增得到的融合基因片段M2e-CtB定向克隆入真核表达载体pcDNA3.1a(+)中, 再转化E.coli JM109.将酶切鉴定、 PCR扩增及序列鉴定正确的重组质粒命名为pcDNA3.1a(+)-M2e/CtB.用KEGEN TRANS Ⅲ阳离子聚合物将重组质粒pcDNA3.1a(+)-M2e/CtB转染NIH3T3细胞, 经免疫荧光、 RT-PCR产物序列分析、 Western blot检测其稳定表达产物.结果: 重组质粒pcDNA3.1a(+)-M2e/CtB含完整的M2e和CtB基因, 与相对应基因的序列同源性分别为100%.重组质粒转染NIH3T3细胞后获得了有效表达, 并且稳筛株细胞裂解物和上清均能用抗霍乱毒素抗体和抗流感病毒抗体检测到Mr约18 000的蛋白条带.结论: 成功构建了真核表达重组质粒pcDNA3.1a(+)-M2e/CtB, 初步证明其在体外表达的重组蛋白可分泌至胞外, 且有M2e和CTB的双特异反应原性和免疫原性, 为流感病毒核酸疫苗的进一步研究奠定了坚实基础.
