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丹参毛状根对麻醉大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用
目的:研究丹参毛状根对麻醉大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用.方法:采用大鼠冠脉结扎致心肌缺血模型.结果:丹参毛状根能显著降低缺血所致室速(VT),室颤(VF)的发生率,降低血浆乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)增高程度,提高超氧化物歧化酶(SOD)活性,与丹参药材比较无显著性差异.结论:丹参毛状根具有和丹参相似的药理作用,为其进一步的研究与开发利用,提供了实验依据.
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丹参毛状根化学成分稳定性研究
目的:研究丹参毛状根的化学物质稳定性,为进一步探索丹参毛状根作为原料药的可行性提供研究基础.方法:PCR扩增10批丹参毛状根的rolA基因,HPLC指纹图谱分析10批丹参毛状根的化学成分稳定性.结果:PCR结果表明,外源基因rolA在10批样品的基因组DNA中均可以检测到;通过对丹参毛状根的指纹图谱研究,10批毛状根的相似度均在0.970以上.结论:不同批次丹参毛状根样品间化学成分的差异不显著.
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丹参毛状根对大鼠离体心脏缺血再灌注损伤的保护作用
目的:观察丹参毛状根对离体大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用.方法:采用Langendorff离体心脏恒压灌流方法,以0.5 mL·min~(-1)的灌流速度,生药质量浓度分别为14,28,56 mg·L~(-1)的丹参毛状根,与k-H灌流液同时灌流心脏10min,然后全心停灌30 min,复灌60 min.结果:离体实验发现,丹参毛状根能够增加冠脉流量,不但降低心律失常的发生率,而且推迟心律失常的发生时间,缩短持续时间和恢复时间,减低LDH,MDA的释放,增加SOD活性.结论:丹参毛状根对大鼠离体心脏缺血再灌注损伤具有一定的保护作用;与丹参药材相比无显著性差异.
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生物与非生物诱导子协同作用对丹参毛状根培养生产丹参酮的影响
目的:考察生物诱导子yeast extract和不同非生物诱导子(Ag+,Co2+,α-氨基异丁酸)协同作用对丹参毛状根培养生产丹参酮的影响.方法:在丹参毛状根培养基中添加不同诱导子及诱导子组合,利用高效液相色谱法检测3种主要丹参酮(隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA)的含量.结果:yeast extract与各非生物诱导子在不同浓度下的组合对丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA都发挥了较好的协同诱导作用,而对隐丹参酮的协同诱导效果不显著.其中,yeast extract和Ag+(300μmol·L-1)协同作用获得了高的丹参酮Ⅰ产量,是对照组含量的13.9倍,诱导协同作用系数为3.0.yeast extract和Co2+(100μmol·L-1)协同作用获得了高的丹参酮ⅡA产量,是对照组含量的14.5倍,协同作用系数为2.1.yeast extract和α-氨基异丁酸(200μmol·L-1)的组合是唯一一个比单个诱导子更有效地提高了隐丹参酮产量的组合,隐丹参酮的产量达到1.28mg·g-1,是对照组含量的30.3倍,诱导协同作用系数为1.3.结论:利用生物诱导子yeast extract和不同的非生物诱导子进行协同作用,其诱导效果比单独使用某一种诱导子的诱导效果更好,这种相互作用可以更有效地促进次生代谢产物的合成.
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诱导子对丹参毛状根中丹参酮类成分积累影响
丹参为唇形科鼠尾草属植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根.丹参原植物具有繁殖能力强,易于栽培的特点,目前国内外展开了大量的组织和细胞培养研究[1-2].
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丹参毛状根不同培养时期有效成分的积累研究
丹参是唇彤科覃本植物丹参Salvia miltiorrhizaBge.的根及根茎,具有活血祛瘀,凉血清心,养血安神的功效,是临床常用的中药.毛状根是农杆菌中Ri质粒的一段DNA嵌入植物基因组中并表达的结果,许多植物受发根农杆菌感染后在受伤部位能长出大量毛状根.由于其生长速度快,不需外源植物激素,合成次生代谢物质能力强而且稳定.毛状根作为一种转基因的器官,一种新的药用原料,越来越被人们所重视.
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诱导子对丹参毛状根酚酸类和丹参酮类成分积累的影响
目的:考察生物诱导子真菌菌丝提取物和非生物诱导子茉莉酸甲酯及二者协同作用对丹参毛状根酚酸类和丹参酮类成分积累的综合性影响.方法:在继代培养21 d的丹参毛状根中添加不同的诱导子及诱导子组合,分别测定不同收获期毛状根的生长量和两大类成分的积累量.结果:3种处理均显著抑制了丹参毛状根的生长,促进了隐丹参酮和二氢丹参酮Ⅰ的积累,但对酚酸类成分的积累却有不同的作用,茉莉酸甲酯可以促进酚酸类成分的积累,真菌诱导子在一定程度上抑制了酚酸类成分的积累.结论:真菌诱导子和茉莉酸甲酯以及二者协同作用对丹参毛状根不同成分的积累具有不同的影响,3种处理条件下水溶性成分的积累和脂溶性成分的积累基本不存在关联性.
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丹参分支酸变位酶基因的克隆和生物信息学分析
应用BlastX检索丹参毛状根的EST数据库,发现1条与分支酸变位酶(chorismate mutase,CM)高度同源的序列,克隆得到其全长cDNA,命名为SmCM1,Genbank登录号为KC784342.SmCM1全长948 bp,理论pI 6.41,与矮牵牛Petunia×hybriida、拟南芥Arabidopsis thaliana和毛果杨Populus trichocarpa的CM1分别具有70％,72％,64％的相似性.实时荧光定量PCR(real time quantitative PCR,QRT-PCR)分析表明SmCM1在丹参叶中的含量较高,其次是茎,在根中的含量相对较低.酵母诱导子(YE)和离子(Ag+)联合诱导丹参毛状根后,SmCM1与莽草酸途径的关键酶3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖-7-磷酸合酶(3-deoxy-7-phosphoheptulonate synthase,DAHPS)和分支酸合酶(chorismate synthase,CS)基因表达趋势呈协同变化.YE+ Ag+处理后3个基因皆上调表达,8h达到表达高峰,分别是对照的7.9,5.5,9.8倍,随后下调,36 h时下降至对照水平以下,说明诱导处理之后糖代谢中间产物经莽草酸和分支酸途径合成苯丙氨酸和酪氨酸从而引起酚酸类化合物的过量积累.
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丹参毛状根的诱导及培养条件的优化
为了建立丹参毛状根的诱导方法及液体培养体系,以发根农杆菌A4,LBA9402,15834为试验菌株分别侵染丹参无菌苗叶片,诱导丹参毛状根,PCR扩增筛选阳性株系,HPLC测定丹酚酸含量并在此基础上进一步优化毛状根的液体培养条件.结果显示:3种发根农杆菌A4,LBA9402,15834均诱导出丹参毛状根,经PCR鉴定证明其Ri质粒T-DNA均已整合到丹参基因组中,其中发根农杆菌LBA9402和A4诱导的丹参毛状根丹酚酸含量较高,质量分数分别为(3.27±0.37)％,(3.17±0.20)％;由发根农杆菌LBA9402诱导MSOH液体培养基培养的丹参毛状根丹酚酸含量较高,质量分数为(4.56±0.36)％;由发根农杆菌LBA9402诱导,pH为4.81的MSOH液体培养基培养的丹参毛状根丹酚酸含量高可达4.85％.因此,以发根农杆菌LBA9402和A4诱导的丹参毛状根在pH为4.81的MSOH液体培养基中培养的丹酚酸含量较高.为进一步利用基因工程技术改良中药丹参的品质奠定了基础.
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茎环法对转ZmC1基因丹参毛状根中microRNA表达分析
目的:对转ZmC1基因丹参毛状根C1-3株系中8个microRNAs(miRNAs),即miR164b、miR166a、miR166b、miR171a、miR171b、miR172、miR394和miR397进行表达定量分析.方法:以野生型丹参毛状根为对照,采用茎环法(Stem-loop),针对每个miRNA设计3条引物,包括一条特异性反转录引物、一条上游引物和一条通用反向引物.每个miRNA单独反转录,实时荧光定量PCR(qPCR)检测转基因丹参毛状根C1-3中8个miRNA的表达,实验数据用△△Ct法进行分析.结果:与野生型丹参毛状根相比,在转基因毛状根C1-3中8个miRNA均表现为不同程度的上调,其中miR394、miR397和miR164为显著,分别为对照的15.14倍、7.31倍和4.82倍.结论:茎环法可以成功应用于检测丹参中miRNA的表达;C1-3中这几个miRNA转录水平上调可能与ZmC1异源表达引起的有效成分含量及形态发育表型变化相关.
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不同干燥方法对丹参毛状根有效成分含量及其抗氧化活性的影响
目的：探讨不同干燥方法对丹参毛状根中主要化学成分含量及其抗氧化活性的影响，尤其关注采后干燥对丹参毛状根酚酸类成分是否也有类似对植物根一样的胁迫诱导作用。方法丹参毛状根经冷冻干燥、真空干燥、阴干和晒干四种不同干燥方式处理后，采用高效液相色谱法测定毛状根中包括9种酚酸类和4种酮类成分的含量；利用1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（ DPPH）自由基清除试验、超氧阴离子清除试验、脂质过氧化抑制试验测定毛状根提取物的抗氧化活性。结果与冷冻干燥相比，真空干燥和阴干对酚酸类成分的影响不大，但酮类成分下降约50％；晒干处理后二类成分均严重损失达90％左右；晒干样品提取物抗氧化活性也显著下降。结论冷冻干燥是适合丹参毛状根的干燥方法；与丹参根不同，采后干燥对毛状根的酚酸类成分无诱导作用。
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脱落酸处理对丹参毛状根中丹参酮积累的影响
目的:研究脱落酸(Abscisic Acid,ABA)处理对丹参酮类成分积累的影响.方法:用发根农杆菌ATCC15834诱导生产丹参毛状根,经20 d悬浮振荡培养后,分别采用20、90、210、400μmol/L的ABA处理,并用HPLC测定ABA处理7d后丹参毛状根中丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、二氢丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA的含量.结果:ABA能够抑制丹参毛状根的生长,20 μmol/L ABA处理对丹参毛状根生长影响不显著,90、210、400 μmol/L的ABA处理条件下,丹参毛状根干重分别减少为对照组的65.2％、71.0％和56.5％;ABA处理能够显著提高丹参毛状根中4种丹参酮的产量,且以210 μmol/L ABA处理下达到高;丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、二氢丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA的含量经ABA处理后分别提高为对照组的5.4、9.5、1.5和1.8倍.结论:ABA能显著促进丹参毛状根中丹参酮类成分的积累.
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植物激素对丹参毛状根生长和丹参酮生物合成的影响
目的:研究植物激素对固体培养丹参毛状根生长和丹参酮ⅡA生物合成的影响.方法:组织培养法诱导毛状根、超声法提取丹参酮、高效液相色谱法测定丹参酮.结果:在1/2 MS培养基中添加一定浓度GA3与6-BA的组合激素对丹参毛状根生长有抑制作用,高抑制作用达到100%(毛状根死亡),而添加1.0 mg/L KT与1.0mg/L IBA的组合激素则可以明显促进丹参毛状根的生长,生长量是对照的3.251倍;添加0.2 mg/L NAA和3.0mg/L 6-BA与3.0 mg/L NAA的组合激素时丹参毛状根体内丹参酮ⅡA的总含量高;添加2.0 mg/L 6-BA则对丹参酮ⅡA的生物合成有显著促进作用,丹参酮ⅡA浓度是对照的3.012倍.结论:在丹参毛状根培养基中加入不同的植物激素及其组合激素对毛状根的生长和丹参酮ⅡA的生物合成有显著的影响.
