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高渗应激早期伤寒沙门菌RpoE调节因子对基因表达的影响
伤寒沙门菌是一种革兰阴性肠道致病菌,常通过污染的食物进入体内,可造成严重全身性感染[1-2].作为食源性致病菌,必须遭遇人体消化道的高渗环境,但目前对其克服高渗应激的具体机制尚不清楚.RpoE调节因子由rpoE基因编码,是肠杆菌科细菌中一个重要的σ因子,在大肠杆菌响应高渗应激时发挥着重要的作用[3],在伤寒沙门菌中也应当十分重要.
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p38丝裂原激活蛋白激酶信号通路参与高渗应激诱导黏蛋白5AC高表达研究
目的 探讨p38丝裂原激活蛋白激酶(P38)信号通路参与高渗应激诱导黏蛋白5AC(MUC5AC)高表达的作用机制.方法 利用545、695、855、1055和1280 mOsm/L高渗氯化钠溶液培养人气道上皮NCl-H292细胞.同时以1280mOsm/L高渗氯化钠为刺激因素,以P38特异性抑制剂SB203580、c-jun氨基末端激酶(JNK)特异性抑制剂SP600125及细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)特异性抑制剂U0126为干预因素,采用RT-PCR技术及ELISA观察培养细胞MUC5AC转录水平和MUC5AC蛋白水平改变.采用Western blotting法检测1280 mOsm/L高渗氯化钠培养上清液中细胞匀浆磷酸化P38(p-P38)、磷酸化JNK(p-JNK)及磷酸化ERK(p-ERK)蛋白水平.结果 分别以545、695、855、1055和1280mOsm/L高渗氯化钠刺激后,培养细胞中MUC5ACmRNA及蛋白含量显著高于对照组(P<0.01),且呈现出与渗透浓度相关的趋势.SB203580显著下调1280mOsm/L高渗氯化钠所致的p-P38含量升高,同时显著下调MUC5ACmRNA及蛋白含量(P<0.05);SP600125则明显下调p-JNK的含量,并下调MUC5ACmRNA转录及蛋白含量(P<0.05),但作用弱于SB203580;1280 mOsm/L高渗氯化钠对ERK的含量无影响(P>0.05),U0126对MUC5ACmRNA转录及蛋白含量也无明显影响(p>0.05).结论 高渗应激可呈浓度依赖性地从转录水平诱导气道上皮细胞呈现黏液高分泌状态,且P38信号通路起主要作用.
关键词： 高渗应激 p38丝裂原激活蛋白激酶 黏蛋白5AC 酶联免疫吸附测定 -
高渗状态下肾脏COX2表达的基因调控
目的本研究旨在阐明核转录因子C/EBPβ和NFκB是否协同作用影响高渗状态下COX2的基因表达.方法体外培养肾髓间质细胞(RMICs),通过病毒转导或质粒转染技术将体外构建的COX2基因突变载体转入培养细胞,经高渗培养不同时间后,采用免疫印迹、荧光素酶报告基因活性检测等方法观察培养细胞COX2蛋白表达及活性的改变,同时应用染色质免疫沉淀分析法观察COX2基因与C/EBPβ、NFκB结合能力的改变.结果免疫印迹显示,高渗刺激能明显提高对照组COX2蛋白表达,应用突变序列IκBm阻断NFκB活性后COX2表达明显下降,应用突变序列C/EBPβ-P20阻断C/EBPβ亦能显著降低COX2表达,但同时运用突变序列C/EBPβ-P20和IκBm无法使COX2表达进一步下降.然而,将野生型、含NFκB或C/EBPβ结合位点突变的COX2启动子萤火虫荧光素酶报告基因的重组质粒转染至RMICs,高渗培养24 h后显示:高渗刺激能显著增加野生型组COX2荧光素酶的活性,NFκB位点突变无法阻断该作用,而C/EBPβ结合位点突变却能完全抑制COX2高活性.进一步应用染色质免疫沉淀分析研究显示,高渗刺激能显著增加NFκB(P65)或C/EBPβ与COX2基因的结合,并呈时间依赖性;NFκB结合位点突变不能消除高渗诱导的NFκB(P65)与COX2基因的结合增强,但在NFκB和C/EBPβ结合位点同时突变组该作用被阻断.结论在NFκB活化COX2基因转录过程中需要另一个核转录因子C/EBPβ的参与,C/EBPβ途径在高渗诱导肾脏内髓间质细胞表达COX2过程中具有重要作用.
关键词： 环加氧酶-2 核转录因子κB 核转录因子C/EBPβ 高渗应激 肾髓间质细胞 -
OsmY缺失对伤寒沙门菌在高渗应激早期基因表达的影响
目的:研究伤寒沙门菌OsmY在高渗应激早期对其他基因表达的调节.方法:通过同源重组的方法利用自杀质粒制备伤寒沙门菌osmY基因缺陷变异株;采用伤寒沙门菌全基因组芯片比较野生株和osmY基因缺陷变异株在高渗应激早期的基因表达差异,并对其中部分表达差异基因进行实时定量PCR验证.结果:成功制备伤寒沙门菌osmY基因缺陷变异株;基因芯片结果显示,在高渗应激早期,与野生株相比,伤寒沙门菌osmY基因缺陷变异株有128个基因表达下调,有27个基因表达上调.实时定量PCR与芯片结果一致.结论:OsmY可作为一调节因子在伤寒沙门菌高渗应激早期对基因表达起重要调节作用.
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Hfq对伤寒沙门菌高渗应激早期基因表达的调节
目的: 探查伤寒沙门菌hfq基因在高渗应激早期对其他基因表达的影响.方法: 用自杀质粒介导的同源重组方法制备伤寒沙门菌hfq基因缺陷变异株;利用伤寒沙门菌全基因组芯片技术,比较伤寒沙门菌野生株和hfq基因缺陷变异株在高渗应激早期的基因表达谱差异,并选择部分表达差异基因进行实时定量PCR验证.结果: 伤寒沙门菌hfq基因缺陷变异株制备成功;基因表达谱比较分析结果表明伤寒沙门菌hfq基因缺陷变异株在高渗应激早期有62个基因表达上调,有32个基因表达下调.实时定量PCR结果与芯片分析一致.结论: Hfq作为一个调节因子在伤寒沙门菌高渗应激早期对基因表达起重要调节作用.
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mig-14对伤寒沙门菌在高渗应激早期基因表达的调节
目的:探查伤寒沙门菌mig-14在高渗应激下对若干基因表达的调节作用.方法:用自杀质粒介导的同源重组方法制备伤寒沙门菌mig-14基因缺陷变异株,用基因芯片分析高渗应激早期野生株和mig-14缺陷株基因表达差异,并对部分结果采用实时荧光定量PCR进行验证.结果:成功制备伤寒沙门菌mig-14缺陷株,高渗应激早期mig-14变异株与野生株相比有77个基因表达下调和72个基因表达上调. 结论:mig-14可能是一种调节基因,主要参与调节细菌的物质和能量代谢.
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PmrA对伤寒沙门菌高渗应激后期基因表达调节初探
目的:探讨伤寒沙门菌调节因子PmrA在高渗应激后期对基因表达调节的影响.方法:应用自杀质粒介导的同源重组方法制备伤寒沙门菌pmrA基因缺陷变异株;利用伤寒沙门菌全基因组芯片分析技术,比较伤寒沙门菌野生株和pmrA基因缺陷变异株在高渗应激后期的基因表达谱差异,并选择部分差异表达基因进行RT-RCR验证.结果:经PCR及序列分析证实,伤寒沙门菌pmrA基因缺陷变异株制备成功;基因表达谱比较分析结果表明伤寒沙门菌pmrA基因缺陷变异株在高渗应激后期有81个基因表达上调,有22 个基因表达下调.结论:PmrA在伤寒沙门菌高渗应激后期的基因表达调节中发挥重要作用.
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高渗应激对肝细胞癌Huh7细胞增殖和凋亡的影响
目的 观察高渗应激对肝细胞癌Huh7细胞增殖和凋亡的影响,并探讨其调控机制.方法 免疫组织化学法检测64例肝细胞癌组织中渗透压调控的转录因子活化T细胞核因子5(NFAT5)的表达；氯化钠模拟肿瘤高渗微环境,Western blot法检测NFAT5蛋白的表达；流式细胞仪检测细胞凋亡；噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞体外增殖活力.结果 癌组织NFAT5的阳性表达率为9.38％,明显低于癌旁组织(68.75％,P＜0.01).高渗24 h组(100 mmol/L NaCl)能使Huh7细胞NFAT5蛋白的表达显著升高(P＜0.01).高渗24 h组(100 mmol/L NaCl)细胞凋亡率[(26.0±3.2)％]明显高于空白对照组[(0.8±0.2)％,P＜0.01].高渗24 h(l00m mol/L NaCl)能明显抑制Huh7细胞增殖,细胞生长抑制率为(31.35±2.09)％(P＜0.01).结论 作为哺乳动物唯一的渗透压调节相关因子NFAT5,肝细胞癌组织与癌旁组织在NFAT5高表达率上差异有统计学意义,高渗应激能上调肝癌细胞NFAT5的表达,诱导肝癌细胞凋亡,并抑制细胞增殖.
