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16S rDNA多重PCR检测牙周组织感染菌及混合感染与慢性牙周炎病变程度关系的研究
目的建立多重16S rDNA PCR检测慢性牙周炎(CP)标本中牙龈卟啉单胞菌(Pg)、伴放线杆菌(Aa)和齿垢密螺旋体(Td),了解不同感染情况与CP严重程度的关系.方法将轻、中和重度152例CP患者牙周袋标本和30名牙周健康者龈沟标本置于200μl裂解缓冲液中,100℃水浴10 min后取10μl上清液作为聚合酶链反应(PCR)模板.常规酚-氯仿法提取的Pg ATCC33277株、AaY4株、Td FM株和E.coli DH5α株DNA分别作为PCR阳性和阴性对照.采用Pg、Aa和Td 16SrDNA特异性引物,建立多重PCR检测上述标本.3例Pg、Aa和Td PCR结果均阳性标本的目的扩增片段T-A克隆后测序.采用x2检验分析不同混合感染情况与牙周炎严重程度之间的关系.结果所建立的多重16S rDNA PCR低可检出10个Pg、20个Aa和20个Td细胞.Pg、Aa和Td 16SrDNA扩增片段与已报道的序列比较,相似性分别高达99.45%、97.08%和96.59%.30名牙周健康者龈沟标本中,仅有1名Pg(3.3%)、2名Aa(6.7%)的16S rDNA扩增结果阳性,其余标本均阴性.152例CP患者牙周袋标本中,147例(96.7%)检出Pg、Aa和/或Td的16S rDNA,5例(3.3%)扩增结果均阴性.Pg的PCR检测阳性率(91.5%,139/152)明显高于Aa(72.4%,110/152)或Td(80.9%,123/152)(x2=7.07,18.67;P＜0.01).89.8%的患者标本有上述2种(26.5%)或3种细菌(63.3%)同时感染,且中、重度牙周炎混合感染率明显高于轻度牙周炎(x2=10.43,P＜0.01).结论所建立的多重16S rDNAPCR有较高的敏感性和特异性,可同时检测临床标本Pg、Aa和Td.CP是一种多种病原菌混合感染性疾病,病原菌协同致病作用与CP严重程度有因果关系.
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PCR检测龈下菌斑中齿垢密螺旋体与牙周组织破坏的关系
目的建立龈下菌斑标本中齿垢密螺旋体PCR临床快速检测方法,了解齿垢密螺旋体感染与慢性牙周炎牙周组织破坏程度之间的关系. 方法 81例慢性牙周炎患者每例采取2个不同患牙牙位的龈下菌斑标本,用终浓度为1%的Triton X-100 100℃水浴10 min处理标本以制备DNA模板,用PCR检测标本中齿垢密螺旋体特有的相对分子质量(Mr)为53×103外膜蛋白基因(tdpA)扩增片段. 结果 67例患者(82.7%)的2份龈下菌斑标本齿垢密螺旋体tdpA PCR均为阳性,9例患者(11.1%)的其中1份龈下菌斑标本可见目的扩增片段,5例患者(6.2%)的2份龈下菌斑标本PCR均为阴性,162例龈下菌斑PCR检测总阳性率为88.3%(143/162).牙槽骨吸收＞2/3和牙周袋深度≥7mm患牙龈下标本的PCR阳性率较高(P＜0.05),牙龈指数与PCR阳性率无明显关系(P＞0.05). 结论 PCR检测tdpA基因可用于慢性牙周炎龈下标本中齿垢密螺旋体的临床快速诊断,齿垢密螺旋体感染与牙周组织破坏密切相关.
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侵袭性牙周炎龈沟液中有机酸与牙龈卟啉单胞菌和齿垢密螺旋体的关系
目的:分析侵袭性牙周炎(aggressive periodontitis,AgP)患者龈沟液中牙龈卟啉单胞菌和齿垢密螺旋体对有机酸浓度的影响,初步探讨有机酸在AgP疾病中的作用.方法:共20例AgP患者和14例健康对照者纳入本研究,每位研究对象每象限选一个位点采集龈沟液,分离上清液采用高效毛细管电泳仪检测琥珀酸、乙酸、丙酸、丁酸和异戊酸,分离沉淀物采用PCR技术检测牙龈卟啉单胞菌和齿垢密螺旋体,并分析其电泳条带的灰度值作为该微生物的PCR产物量.结果:AgP组龈沟液中琥珀酸、乙酸、丙酸、丁酸和异戊酸的浓度,牙龈卟啉单胞菌、齿垢密螺旋体的检出率和PCR产物量均显著高于健康对照组,其中在牙龈卟啉单胞菌检出组中丁酸浓度显著高于未检出组[2.87 (0.99,4.36) mmol/Lvs.0.33 (0.00,1.44) mmo/L,P＜0.05],琥珀酸、乙酸、丙酸、丁酸和异戊酸浓度均与牙龈卟啉单胞菌产物量呈正相关(r值分别为0.334,0.548,0.411,0.493,0.273,P＜0.05).齿垢密螺旋体检出组中有机酸浓度均高于未检出组,琥珀酸1.67 (1.15,2.11) mmol/Lvs.0.80 (0.48,1.06) mmol/L,乙酸31.95(23.77,43.13) mmol/Lvs.12.51 (7.57,15.69) mmol/L,丙酸11.86 (6.55,14.98) mmol/Lvs.2.82 (1.71,7.03)mmol/L,丁酸3.45 (2.41,4.78) mmol/Lvs.0.54 (0.00,1.56) mmol/L,异戊酸2.23 (1.05,3.85) mmol/Lvs.0.62(0.00,2.33) mmol/L,琥珀酸、乙酸、丙酸和丁酸与齿垢密螺旋体产物量呈显著正相关(r值为0.443,0.702,0.625,0.557,P＜O.05).结论:AgP患者龈沟液中琥珀酸、乙酸、丙酸和丁酸的浓度在一定程度上反映了牙龈卟啉单胞菌和齿垢密螺旋体的产物量,可以作为判断AgP发生与进展的指标.
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Vector 牙周治疗仪治疗慢性牙周炎龈下微生物变化的研究
目的：观察 Vector 牙周治疗仪治疗慢性牙周炎前后龈下菌群微生物的改变。方法选择20例慢性牙周炎患者，每位患者选取第1、4象限各1颗 PD ≥5 mm 磨牙或前磨牙为龈下菌斑位点，采集治疗前、治疗后1个月、3个月及6个月时的龈下菌斑，通过定量 Pcr 技术检测样本中牙龈卟啉单胞菌、福赛坦氏菌和齿垢密螺旋体的表达量。结果治疗后1个月、3个月及6个月时牙龈卟啉单胞菌、福赛坦氏菌和齿垢密螺旋体的量均比治疗前明显下降（P ＜0.01）。结论 Vector 牙周治疗仪治疗慢性牙周炎能显著减少深牙周袋内牙龈卟啉单胞菌、福赛坦氏菌和齿垢密螺旋体的量。
关键词： Vector 牙周治疗仪 牙龈卟啉单胞菌 福赛坦氏菌 齿垢密螺旋体 PCR -
一氧化氮和一氧化氮合成酶在牙周病发病中的研究
龋病和牙周病是当今世界口腔的两大类主要疾病，在世界范围内均有较高的患病率，而在我国，牙周病的患病率更居于龋病之上，牙周病甚至和包括糖尿病在内的全身系统性疾病互为因果。牙周病患者的临床表现有牙齿松动、牙龈充血、牙槽骨吸收，究其原因还是由于不良的生活习惯造成的。研究表明，牙菌斑生物膜的形成是牙周病发生发展的始动因子，是多种细菌参与的结果，主要的细菌有牙龈卟啉单胞菌、链球菌、齿垢密螺旋体、中间普氏菌等；牙周病还是微生物群和宿主免疫对抗的结果。目前治疗的方法主要是控制菌斑的早期预防，即龈上洁治和龈下刮治；同时将甲硝唑作为治疗牙周病的首选药物。尽管有较好的疗效，但周期长，且易复发。之所以目前的研究和临床应用并未完全有效地控制牙周病的产生和发展，是因为牙周病的作用机制还尚未得到全面的掌握。本实验旨建立 Wistar 大鼠模型，系统地论述一氧化氮（ NO ）和一氧化氮合成酶（ NOs）在牙周病发生发展中的具体作用机制及生物学效应，为牙周病的病因学研究、药物研发和临床治疗奠定理论基础。
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COPD患者口腔和呼吸道内牙龈卟啉单胞菌、齿垢密螺旋体和福赛坦菌的同源性分析
目的 分析慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者口腔和呼吸道内牙龈卟啉单胞菌(Pg)、齿垢密螺旋体(Td)和福赛坦菌(Tf)的同源性,探讨牙周炎与COPD之间的关系.方法 收集53例急性加重期COPD患者,采集龈下菌斑及呼吸道分泌物,同时进行牙周指标的检查.通过16S rDNA序列分析,构建患者口腔及呼吸道内Pg、Td和Tf的系统进化树,进行同源性分析.结果 53例患者中,5例患者口腔和呼吸道内Pg具有同源性,6例患者Td具有同源性,3例患者Tf具有同源性.结论 COPD患者口腔和呼吸道内Pg、Td和Tf具有同源性,COPD患者呼吸道内的这3种病原体均来自于口腔.
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红色复合体与逆行性牙髓炎的相关性研究
目的:研究牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)、福赛坦氏菌(Tannerella forsythus,Tf)和齿垢密螺旋体(Treponema denticola,Td)与逆行性牙髓炎的相关性.方法:采集逆行性牙髓炎患牙的牙髓组织(40例),应用SYBR Green实时荧光定量聚合酶链反应法定量监测患牙牙髓组织中Pg、Tf、Td三种微生物以及总的细菌量.结果:逆行性牙髓炎患牙牙髓组织中Pg、Tf和Td的检出率分别为22.5％、82.5％和47.5％,三种微生物之间具有协同致病效应,OR值及95％可信区间为2.83(1.26 ～6.38).结论:红色复合体(Pg、Tf、Td)与逆行性牙髓炎牙髓组织的感染密切相关.
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齿垢密螺旋体PCR检测与牙周炎病变程度关系
目的建立龈下菌斑标本中齿垢密螺旋体二重PCR临床快速检测方法,了解齿垢密螺旋体感染与慢性牙周炎(CP)病变程度的关系.方法对158例不同病变程度的慢性牙周炎龈下菌斑标本,采用PCR检测标本中齿垢密螺旋体16S rDNA和特征性外膜蛋白基因tdpA.结果85.4%标本16S rDNA阳性,77.2%tdpA阳性,14.6%两者均阴性,未发现tdpA阳性而16S rDNA阴性的标本.重度CP龈下菌斑标本16S rDNA和tdpA检出率均高于中度CP,中度CP龈下菌斑标本16S rDNA和tdpA检出率均明显高于轻度者.结论二重PCR可用于牙周炎龈下标本中齿垢密螺旋体的临床快速诊断,齿垢密螺旋体感染与牙周病变程度密切相关.
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二重PCR检测龈下菌斑中齿垢密螺旋体感染及其与牙周炎病变程度的关系
目的建立龈下菌斑标本中齿垢密螺旋体二重PCR临床快速检测方法,了解齿垢密螺旋体感染与慢性牙周炎病变程度之间的关系.方法采取158例不同病变程度的慢性牙周炎龈下菌斑标本,用终浓度为1%的Triton X-100 100℃水浴10 min处理标本以制备DNA模板,采用PCR检测标本中齿垢密螺旋体16S rDNA和特征性外膜蛋白基因tdpA.采用卡方检验分析齿垢密螺旋体感染与慢性牙周炎(CP)不同病变程度的关系.结果 85.4%(135/158)标本16S rDNA阳性,77.2%(122/158)tdpA阳性,14.6%(23/158)两者均阴性,未发现tdpA阳性而16S rDNA阴性的标本.重度CP龈下菌斑标本16S rDNA和tdpA检出率均高于中度CP(χ2=4.03,5.71;P＜0.05),中度CP龈下菌斑标本16S rDNA和tdpA检出率均明显高于轻度(χ2=9.32,16.06,P＜0.01).结论所建立的二重PCR可用于牙周炎龈下标本中齿垢密螺旋体的临床快速诊断,齿垢密螺旋体感染与牙周病变程度密切相关.
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16S rDNA多重PCR检测牙龈卟啉单胞菌、伴放线放线杆菌和齿垢密螺旋体及混合感染与慢性牙周炎病变程度关系
目的 建立多重16S rDNA PCR方法用以同时检测慢性牙周炎(CP)临床标本中牙龈卟啉单胞菌(Pg)、伴放线放线杆菌(Aa)和齿垢密螺旋体(Td)，并了解不同感染情况与慢性牙周炎严重程度的关系。方法 采集152例CP患者牙周袋标本，并按Hugoson的方法将其分为轻、中和重度三类，另采集30例牙周健康者龈沟标本作为正常对照。上述临床标本置于200μl裂解缓冲液中，100℃冰浴10 min后取10μl上清液直接作为PCR的模板。采用常规酚-氯仿法提取Pg ATCC33277株、Aa Y4株、Td FM株和E.coli DH5α株的DNA分别作为PCR的阳性和阴性对照。采用Pg、Aa和Td 16S rDNA特异性引物，建立多重PCR检测上述标本。3例Pg、Aa和Td PCR结果均阳性患者牙周袋标本目的扩增片段T-A克隆后测序。采用χ2检验分析Pg、Aa和/或Td感染率与牙周炎严重程度之间的关系。结果 所建立的多重16S rDNA PCR低可检出10个Pg、20个Aa和20个Td细胞。Pg、Aa和Td 16S rDNA扩增片段测序结果与已报道的相应序列比较，相似性分别高达99.45％、97.08％和96.59％。30例牙周健康者龈沟标本中，仅有1例(3.3％)Pg、2例(6.7％)Aa的16S rDNA扩增结果阳性，其余标本均阴性。152例CP患者牙周袋标本中，147例(96.7％)检出Pg、Aa和/或Td的16S rDNA，5例(3.3％)扩增结果均阴性。Pg的PCR检测阳性率(91.5％，139/152)明显高于Aa(72.4％，110/152)或Td(80.9％，123/152)(χ2=7.07，18.67；P＜0.01)。89.8％的患者标本有两种(26.5％)或三种微生物(63.3％)同时感染，且中、重度牙周炎混合感染率明显高于轻度牙周炎(χ2=10.43，P＜0.01)。结论 所建立的同时检测多重16S rDNA PCR有较高的敏感性和特异性，可用于临床Pg、Aa和Td实验室检测。多种牙周病原微生物协同致病作用与CP严重程度有因果关系。
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不同牙周状况龈下菌斑中齿垢密螺旋体的分布
目的:分析慢性牙周炎、牙龈炎患者和牙周健康者龈下菌斑中齿垢密螺旋体的分布情况,探讨该微生物与不同牙周状况的关系.方法:收集12例慢性牙周炎、5例牙龈炎患者和5例牙周健康者,共70个位点的龈下菌斑,采用TaqMan 16S rRNA 实时荧光定量PCR技术检测齿垢密螺旋体的分布.结果:慢性牙周炎病变位点齿垢密螺旋体检出率是86%,牙龈炎的是86%,牙周健康的是100%,3组检出率之间的差异没有统计学意义;微生物的检出量经对数转换后,3组之间及两两比较均有统计学意义.结论:TaqMan实时荧光定量PCR技术检测微生物灵敏度高,检出率高;龈下菌斑中齿垢密螺旋体与牙周状态密切相关.
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不同引物检测慢性牙周炎龈下菌斑中齿垢密螺旋体
目的:利用两个不同引物对慢性牙周炎患者患病部位及相对健康部位龈下菌斑中齿垢密螺旋体(Td)进行检测,以了解Td在慢性牙周炎患者不同部位的分布及Td检出率与牙周炎临床指标的关系.方法:收集58例慢性牙周炎患者患病部位及相对健康部位龈下菌斑标本,利用PCR分别扩增53 kDa外膜蛋白表达基因tdpA片段及16 s rRNA保守区片段.结果:58个患病部位龈下菌斑标本中tdpA及16 s rRNA扩增的阳性率分别为58.6%和81.0%,而相对健康部位龈下菌斑标本中PCR 阳性率分别为8.62%及15.5%,患病部位Td检出率高于相对健康部位(P<0.001),16 s rRNA基因片段引物检出率高于tdpA基因片段(P＜0.05).临床附着丧失≥5 mm的患牙龈下菌斑标本中Td的检出率高于临床附着丧失＜5 mm标本(P＜0.05),不同牙周袋深度及牙龈指数标本的Td检出率之间差异无统计学意义(P＞0.05).结论:在慢性牙周炎患者活动部位龈下菌斑中Td检出率高于相对健康部位;Td感染与慢性牙周炎关系密切;利用16s rRNA保守区片段对齿垢密螺旋体进行检测检出率高于tdpA基因片段.
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RT-qPCR检测CPC对中重度慢性牙周炎患者口内环境中红色复合体的影响
目的:利用RT-qPCR检测CPC对中重度慢性牙周炎患者口内环境中红色复合体构成比的影响.方法:临床选择40例中重度慢性牙周炎患者,随机分成CPC(试验)组、溶媒(对照)组,牙周基础治疗后分别使用该药品含漱+袋内冲洗.记录患者基线和用药4周后的临床指标;采集龈下菌斑、龈沟液和唾液样本,BANA试验检测胰蛋白酶样酶含量,RT-qPCR检测P.gingivalis、T.forsythia、T.denticola在总菌量中的构成比.结果:治疗后:1)试验组AL、BOP、PLI显著改善(P<0.01),对照组仅AL改善(P<0.01);2)两组龈下菌斑和龈沟液样本中胰蛋白酶样酶含量均显著下降(P<0.05);3)两组P.gingivalis构成比均显著下降(P<0.01),T.forsythia在试验组构成比显著下降(P<0.01),而T.denticola治疗前后无变化;4)P.gingivalis、T.forsythia、T.denticola两两之间构成比均显著相关(P<0.01).结论:CPC可抑制牙菌斑形成,改善患者的临床症状,并对龈下菌斑中的P.gingivalis有一定的抑制作用,临床上可用于辅助治疗中重度慢性牙周炎.
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实时定量PCR结合DGGE检测慢性牙周炎患者不同生境中的牙龈卟啉单胞菌和齿垢密螺旋体
目的:利用实时定量PCR结合变性梯度凝胶电泳技术(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)检测慢性牙周炎患者不同生境中牙龈卟啉单胞菌、齿垢密螺旋体.方法:选取30名慢性牙周炎志愿者,分别采集龈上菌斑、龈下菌斑及唾液样本,运用DGGE技术比较分析各组样本微生物群落结构.通过偏小二乘法(partial least squares,PLS)分析,得出不同生境相关优势条带,并对其进行克隆、测序分析,确定相应近邻居.采用实时定量PCR技术对龈下菌斑与龈上菌斑、龈下菌斑与唾液中牙龈卟啉单胞菌及齿垢密螺旋体进行定量检测分析.结果:实时定量PCR定量检测结果显示,龈下菌斑中牙龈卟啉单胞菌及齿垢密螺旋体含量高于龈上菌斑和唾液.结论:实时定量PCR技术结合DGGE技术能更好的诠释微生物群落信息.
关键词： 实时定量PCR 变性梯度凝胶电泳技术 牙周炎 牙龈卟啉单胞菌 齿垢密螺旋体 -
感染根管中齿垢密螺旋体PCR检测及其与临床症状的关系
目的 了解感染根管中齿垢密螺旋体的定植情况及其与临床症状的关系.方法 采用16S rDNA PCR方法,检测53例慢性根尖周炎患者的感染根管内标本中齿垢密螺旋体.结果 齿垢密螺旋体的检出率为24.53%(13/53),其中有症状组18.18%(6/33),无症状组35.00%(7/20);经Fisher确切概率检验,P＝0.200,两组间齿垢密螺旋体检出率差异无统计学意义.结论 齿垢密螺旋体可能是根尖周炎的病原体之一,但与临床症状关系尚未确定.
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齿垢密螺旋体精氨酸激酶TDE2037的原核表达与纯化
目的:构建齿垢密螺旋体TDE2037基因的原核表达质粒,表达及纯化TDE2037精氨酸激酶蛋白.方法:以齿垢密螺旋体基因组DNA为模板,PCR扩增TDE2037基因,PCR产物经限制性内切酶消化后,由T4 DNA连接酶连接原核表达载体pET-21a以及pET28a-SUMO,连接产物分别转化大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达目的蛋白,采用镍柱亲和层析法纯化目的蛋白,并使用分子排阻预装柱提高蛋白纯度.结果:成功构建TDE2037基因的原核表达质粒,经测序与基因库(Genbank)的TDE2037序列一致,在大肠杆菌BL21(DE3)中成功诱导表达目的蛋白,融合蛋白由pET-2 1a-TDE2037表达形成包涵体;由pET28a-TDE2037-SUMO表达部分形成包涵体,部分为可溶蛋白.镍柱亲和层析法成功纯化目的蛋白.结论:成功构建齿垢密螺旋体TDE2037基因的原核表达质粒,并表达纯化了重组融合目的蛋白,为下一步研究奠定基础.
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齿垢密螺旋体主要外鞘蛋白的结构和作用机制
主要外鞘蛋白（Mosp）广泛存在于密螺旋体的菌体表面，常以低聚物的形式存在，分别由葡萄糖、半乳糖、谷氨酰胺、氨基半乳糖和岩藻糖组成。Mosp的中央结构域，在介导细菌与宿主蛋白的黏附中起着至关重要的作用。Mosp竞争性地抑制齿垢密螺旋体与具核梭杆菌和牙龈卟啉单胞菌的结合，即Mosp在齿垢密螺旋体与牙周致病菌共聚中起着类黏附蛋白的作用。Mosp的细胞毒性即成孔效应，包括营养摄取，转运细菌产物至感染的宿主细胞，介导细胞的杀伤作用。Mosp可通过影响成纤维细胞、中性粒细胞的细胞骨架破坏其迁移运动能力，而成纤维细胞的迁移与牙周结缔组织的改建和愈合相关，中性粒细胞又是牙周固有免疫的关键细胞，可牵制致病菌的扩散。深入研究Mosp的作用机制，可为降低齿垢密螺旋体的致病性提供新的思路，为控制牙周炎的进展奠定坚实的理论基础。
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齿垢密螺旋体外膜蛋白与牙周炎研究进展
齿垢密螺旋体(T.d)被认为是牙周炎可疑致病菌之一,其外膜蛋白在牙周炎发病机制中起主要作用.本文就齿垢密螺旋体外膜蛋白在牙周炎发病过程中的作用作一简要综述.
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齿垢密螺旋体糜蛋白酶样蛋白酶复合物及其致病作用
齿垢密螺旋体作为龈下菌斑红色复合体中的一员,与牙周炎症密切相关.其表面的糜蛋白酶样蛋白酶复合物(CTLP)是齿垢密螺旋体的一个重要的毒力因子.CTLP参与介导了齿垢密螺旋体的多种致病机制,包括对组织细胞和组织蛋白的黏附及侵入,与其他牙周致病菌协同形成致密生物膜,产生细胞毒作用,破坏上皮屏障、侵入深层牙周组织,降解组织蛋白,调节宿主源性蛋白酶的激活,引发宿主的免疫调控紊乱,具有多方面的致病作用.深入研究CTLP,有助于诠释口腔螺旋体的致病机制,丰富牙周病的病因及发病机制.
关键词： 牙周病 齿垢密螺旋体 糜蛋白酶样蛋白酶复合物 -
齿垢密螺旋体在慢性牙周炎龈下菌斑中的分布
目的:采用聚合酶链反应(PCR)技术,检测慢性牙周炎患者患病部位和相对健康部位龈下菌斑中齿垢密螺旋体(Treponema denticola,Td),了解齿垢密螺旋体在不同部位龈下菌斑中的分布情况,并探讨其检出率与慢性牙周炎的关系.方法:选择58例慢性牙周炎患者患病部位和相对健康部位龈下菌斑,对齿垢密螺旋体tdpA基因片段进行扩增和克隆测序.结果:34例(58.6%)患病部位PCR为阳性,相对健康部位中5例(8.62%)PCR为阳性,患病部位齿垢密螺旋体检出率高于相对健康部位(P＜0.001).对tdpA基因克隆后测序,结果与Blast比对与Gen Bank中已登陆的tdpA基因同源性为94%.结论:在慢性牙周炎患者患病部位龈下菌斑中,齿垢密螺旋体检出率高于相对健康部位,与慢性牙周炎关系密切,利用PCR方法检测Td,简便、特异性高.
