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结核分支杆菌mRNA定量检测作为活菌标志及其用于利福平敏感性分析的研究
目的:探讨结核分支杆菌mRNA作为活菌检测分子标志的可行性,评价mRNA定量法进行结核分支杆菌利福平敏感性分析的应用价值.
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结核分枝杆菌活菌检测方法及应用
结核病是古老的传染性疾病,已在人类社会肆虐了数千年.当今,结核病仍然严重威胁着人们的生命健康.结核病发生和蔓延的过程也是人类同结核病做斗争的历程,自1882年Koch发现结核分枝杆菌是结核病的病原菌以来的100余年,特别是分子生物学技术应用后,人类对结核分枝杆菌的生物学特性、致病机制、耐药机制、诊断方法、抗结核药物的研制等方面都取得了具大的成就.结核分枝杆菌死活的鉴别具有临床意义及广泛的应用价值,是结核病的诊断、药物敏感性实验、化疗反应监测、新抗结核药物筛选及结核病预防等研究的基础.随着人们对结核分枝杆菌认识的不断深入,活菌检测的新方法也不断出现,而结核分枝杆菌的药物敏感性试验,特别是化疗疗效的评价对活菌的存在有严格的依赖性,下面我们主要对结核分枝杆菌的活菌检测方法及其在药敏分析、化疗监测方面应用的研究情况作一概述.
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基于Ag85B mRNA的荧光定量逆转录PCR快速检测活结核分枝杆菌方法的建立和评价
目的 建立评价荧光定量逆转录PCR快速检测活结核分枝杆菌的方法.方法 建立检测Ag85B mRNA的荧光定量逆转录PCR方法,评价其特异性、灵敏度、重复性、区分细菌存活状态及检测临床样本的能力.结果 该方法特异性强,仅扩增结核分枝杆菌.低检出限是50 Copies/反应,菌落灵敏度为1.3×103cfu/ml,重复性好,可有效区分死菌和活菌.以培养法为“金标准”,PCR法的灵敏度为100.00％,特异度为84.38％,符合率为93.15％,Kappa值为0.86.结论 荧光定量逆转录PCR检测方法简便、快速、可靠,能有效区分结核分枝杆菌的存活状态,具有较高灵敏度和特异性,适用于临床样本的检测,为结核病的早期诊断、疗效评价及药敏情况分析提供了技术支持,有利于结核病的防控.
关键词： 结核分枝杆菌 活菌检测 荧光定量逆转录PCR Ag85B mRNA -
RT-PCR方法检测单核细胞增生李斯特活菌研究
目的:建立单核细胞增生李斯特活菌快速检测技术,解决PCR带来的假阳性问题.方法:采用以mRNA为基础的RT-PCR方法对单核细胞增生李斯特氏菌的hlyA基因进行检测,设计引物,扩增,并作了特异性和灵敏度比较.结果:该引物能较好地扩增单核细胞增生李斯特菌的特异性片断,而对其它的李斯特菌以及常见食源性致病菌无特异性扩增条带;检测的灵敏度纯菌可达到1×104 cfu/ml,人工污染样品猪肉、虾肉和牛奶等培养12～16 h,可达4.5 cfu/ml(g).结论:可以应用该方法对样品中单核细胞增生李斯特活菌进行检测,能较好地解决PCR检测所带来的假阳性问题.
关键词： mRNA RT-PCR 单核细胞增生李斯特菌 活菌检测 hlyA基因 -
肠出血性大肠杆菌O157∶H7活菌检测技术研究进展
大肠埃希菌(Escherichia,E.coli),俗称大肠杆菌,是一类寄居于人和动物肠道的正常菌群优势菌种,是人类重要的条件致病菌,可引起肠道内和肠道外的感染[1].肠出血性大肠杆菌(EHEC)是大肠杆菌的一个亚型,包括O157、O111、O26等血清型,O157∶H7是其常见的血清型之一,因可导致出血性肠炎而得名;可引起感染性腹泻,是与人类疾病相关的具代表性的血清型之一.
关键词： 肠出血性大肠杆菌O157∶H7 活菌检测 综述 -
EMA-PCR方法检测饮用水中3种食源性致病菌活菌研究
目的 将EMA (Ethidium Monoazide Bromide)选择渗透性与PCR技术相结合,建立有效快速检测饮用水中3种食源性致病菌活菌EMA-PCR方法.方法 以鼠伤寒沙门菌invA、肠出血性大肠杆菌O157∶H7 rfbE、铜绿假单胞菌oprI基因为PCR检测靶基因,纯培养物提取模板进行PCR,进行EMA使用浓度及灵敏度试验.结果 EMA浓度不大于10μg/ml对活菌DNA扩增没有明显抑制,终浓度为1μg/ml EMA能有效抑制死菌扩增;对鼠伤寒沙门菌、肠出血性大肠杆菌O157∶H7、铜绿假单胞菌的EMA-PCR灵敏度分别为1.2×104 CFU/ml、2×105 CFU/ml、3×104 CFU/ml;用10 μg/ml EMA处理饮用水水样,可同时检测出饮用水中含有的3种食源性致病菌活菌.结论 EMA-PCR方法可一次检测饮用水中3种食源性致病菌活菌,能避免PCR检测可能造成假阳性结果.
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EMA-PCR技术检测金黄色葡萄球菌活菌
目的 将叠氮溴化乙锭(Ethidium monoazide bromide,EMA)与聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)相结合,建立一种快速、有效检测金黄色葡萄球菌活菌的方法.方法 用EMA处理金葡菌培养物后提取模板,以金黄色葡萄球菌耐热核酸酶编码基因(nuc基因)为靶基因进行PCR反应,并对EMA浓度和曝光时间等条件进行优化.结果 当检测2×10 6 CFU/ml的金黄色葡萄球菌时,能有效抑制死菌DNA扩增的EMA小浓度为0.3μg/ml,对活菌DNA扩增没有明显抑制的EMA大浓度为2μg/ml;经EMA处理后,从含有1％金黄色葡萄球菌活菌混合悬液制备的DNA中可扩增出目的片段.结论 EMA-PCR能有效检测金黄色葡萄球菌活菌,在临床医学和公共卫生领域检测中具有重要的实用价值.
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EMA-PCR方法快速检测铜绿假单胞菌活菌研究
目的 探讨将叠氮溴乙锭(ethidium monoazide bromide,EMA)选择渗透性与PCR技术相结合(EMA-PCR),建立有效快速检测铜绿假单胞菌活菌的方法.方法 以铜绿假单胞菌oprI基因为PCR检测靶基因,纯培养物提取模板进行PCR,检测PCR灵敏度、EMA使用浓度和曝光时间优化试验.结果 PCR检测灵敏度为3×103 CFU/mL;曝光处理时间为10 min; EMA浓度≤5μg/mL对活菌DNA扩增没有明显抑制,终浓度为1 μg/mL EMA能有效抑制3×106 CFU/mL死菌扩增;1％活菌混合体系检测结果阳性.结论 EMA-PCR方法能有效快速检测铜绿假单胞菌活菌,能避免PCR检测可能造成的假阳性结果.
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EMA-PCR技术检测肠出血性大肠杆菌O157∶H7
目的 将叠氮溴化乙锭(ethidium monoazide bromide,EMA)与PCR技术相结合,建立一种有效、快速检测活肠出血性大肠杆菌O157∶H7的方法.方法 以rfbE为PCR检测靶基因,O157∶H7培养物经EMA处理后制备模板进行PCR检测,并对EMA使用浓度、作用时间等进行优化.结果 不抑制O157∶H7活菌PCR扩增的大EMA浓度为10 μg/mL;抑制2×107 CFU/mL死菌PCR反应的小EMA浓度为0.5 μg/mL;该法对O157∶H7检测的灵敏度为2×104 CFU/mL,结果显示能检出混合体系中含有的1％的活菌.结论 EMA PCR技术能有效检测活的O157∶H7,在突发公共卫生事件的快速检测中具有良好的应用前景.
关键词： 肠出血性大肠杆菌O157∶H7 PCR 叠氮溴化乙锭 活菌检测
