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染氟成骨细胞内质网应激分子及骨转化功能的变化
目的 了解氟致成骨细胞内质网应激状态时成骨细胞分化相关基因的表达情况.方法 用原代培养的人成骨细胞建立染氟模型,流式细胞仪测定凋亡指数,并提取RNA后用PCR芯片分别检测未折叠蛋白反应和骨分化相关基因的表达情况.结果 氟能够引起成骨细胞内质网应激,引起15个基因表达上调,1个基因表达下调,其中涉及内质网应激PERK、IRE1和ATF6三条信号途径.骨分化方面有32个基因表达上调,2个基因表达下调,涉及胶原、基质金属蛋白酶、整合素、骨形态发生蛋白、血管生长因子、肿瘤坏死因子等基因.结论 氟引起成骨细胞内质网应激的同时,对骨转化基因的表达也产生影响.
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内毒素休克大鼠脑组织细胞因子基因表达谱的PCR芯片动态研究
目的:研究91个炎症细胞因子基因在内毒素休克大鼠脑组织动态差异表达情况.方法:动物选用体质量180-200g的6-8周龄SD大鼠48只,随机分为空白对照1、2、3、6h组与模型1、2、3、6h组,每组6只.建立内毒素休克大鼠模型,首次采用PCR芯片技术,检测并分析内毒素休克大鼠脑组织1、2、3、6h不同时间段的基因表达情况,统计方法采用△△Ct.结果:①芯片实验结果,模型组与空白对照组比较得到差异表达基因67个,占总基因的73.6％.差异表达基因在1、2、3、6h不同时间有动态变化.按生物学功能分类:信号转导34个,炎症应答36个,G蛋白偶联受体蛋白信号转导途径20个,细胞凋亡11个,细胞增殖15个,趋化性33个,调控转录2个,钙离子稳态7个.②ELISA法测定IL-1α结果,模型组与空白对照组比较1h组明显下降(P＜0.01),2h组、3h组无显著性差异,6h组明显升高(P＜0.01),并且在6h时模型组IL-1α含量为4个时间段的高值,与芯片变化规律基本相同.结论:通过对大鼠脑组织细胞因子基因表达谱的构建,筛查出与内毒素休克脑损伤密切相关的细胞因子有趋化因子配体7(Cc17)、趋化因子配体11 (Ccl11)、趋化因子配体9(Ccl9),并且发现主要的信号转导途径有G蛋白偶联受体蛋白信号转导途径.
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电化学实时定量PCR仪热循环系统温度特性研究
为使电化学实时定量PCR仪能够满足PCR扩增过程对温度特性的要求,对普通PCR芯片进行了结构和材料方面的优化,设计了一种电化学实时定量多通道PCR芯片.利用有限元仿真软件ANSYS分析了PCR芯片温度特性,并提出了隔热和热补偿的措施来改善电化学实时定量PCR仪的热循环系统,通过仿真验证了方案的有效性.首先采用环形结构改善芯片各通道温度的一致性；同时针对电化学检测特点,采用由单晶硅片、铝片和聚碳酸酯组成的三层结构来减小芯片反应池的热迟滞性.其次,在该芯片有限元模型的基础上进行温度场仿真；先采用稳态分析方法确定隔热层厚度与热补偿温度来削弱芯片与外围空气的对流换热作用,以改善芯片的温度准确性与均匀性；再通过瞬态分析测试改善后热循环系统中芯片的热迟滞性和恒温性.改善后热循环系统的热分析结果为:芯片温度准确性与均匀性误差小于0.2℃,各通道温度一致性误差为0℃,试剂升降温速度分别为4℃/s和3℃/s.结果表明该热循环系统的温度特性能够满足PCR仪工作性能的要求.
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辛伐他汀对人急性单核细胞白血病SHI-1细胞PI3K/AKT通路的影响
本研究探讨羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶抑制剂辛伐他汀对人急性单核细胞白血病株( SHI-1)细胞增殖和凋亡的影响及PI3K/AKT通路变化.取对数生长期细胞,实验分为阴性对照组和辛伐他汀处理组(终浓度分别为5、10、15 μ mol/L),培养24、48、72 h.采用MTT法观察SHI-1细胞增殖能力；流式细胞术测定SHI-1细胞凋亡指标变化；PCR芯片研究SHI-1细胞pI3 K/AKT通路84个特异性基因mRNA的差异表达.结果表明,辛伐他汀对SHI-1细胞有明显抑制增殖和促凋亡作用,呈时间与剂量依赖性.15 μmol/L辛伐他汀处理SHI-1细胞24、48、72h,细胞增殖抑制率分别为26.82％、47.09％、63.92％,细胞早期凋亡率分别为5.73％、13.25％、15.59％.与对照组相比,15 μmol/L辛伐他汀处理SHI-1细胞48 h组中有39个基因表达发生改变,其中26个基因表达下调、13个基因表达上调.结论:辛伐他汀能抑制SHI-1细胞增殖并诱导其凋亡,其诱导凋亡机制可能与辛伐他汀调节PI3K/AKT通路相关基因的表达有关.
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氟化钠致人成骨细胞凋亡相关基因分析
背景：目前氟致成骨细胞凋亡对线粒体凋亡通路研究不系统，缺乏系统连贯性，不能明确氟引起成骨细胞凋亡具体传导路径。目的：分析氟致成骨细胞凋亡的可能途径及分子特征。方法：以人成骨肉瘤细胞系Saos-2建立体外染氟模型，体外培养细胞后经不同质量浓度NaF(0，5，10，20，40，80 mg/L)处理。用流式细胞仪检测干预24 h后的线粒体膜电位；用PCR功能芯片检测84个与凋亡相关基因；对部分差异表达基因用免疫印记法予以验证。结果与结论：当氟化钠质量浓度为20，40，80 mg/L时，成骨细胞线粒体膜电位分别为27.0%，28.8%，38.6%(P均<0.05)；PCR芯片检测发现13个基因表达上调，15个基因表达下调。免疫印记显示Bim、Caspase 9、Caspase 14、BCL2、BAX表达随氟化钠剂量增高而增强；Caspase 3在5 mg/L时表达减弱，10 mg/L以上表达逐渐增强。Caspase 7在各组的表达未见明显差异。Caspase 10表达随氟化钠剂量增高而减弱。结果提示，氟致成骨细胞凋亡可能是通过线粒体途径(包括内质网应激途径)及死亡受体途径。
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CD3/CD28共刺激调节T细胞多重信号转导通路的基因mRNA表达
目的 观察激活T细胞中信号转导通路的基因变化情况.方法 小鼠T 细胞体外经CD3/CD28共刺激4小时,提取RNA,以"信号转导通路发现者"PCR芯片分析18个信号转导通路相关的84个关键基因的mRNA改变情况.结果 CD3/CD28共刺激调节了43个基因,其中上调24个,下调19个,涵盖检测的所有18条信号转导通路.结论 多重信号通路共同参与了T细胞的激活过程.
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棕榈酸下调载脂蛋白M表达及其机制研究
目的 明确棕榈酸对载脂蛋白M(apolipoprotein M,ApoM)表达的影响及其机制.方法 用不同浓度棕榈酸处理人肝癌细胞株(HepG2细胞),采用实时定量PCR及PCR芯片分析棕榈酸对ApoM表达的影响和可能的机制.分别用棕榈酸(1 mmol/L)和(或)PI-3K抑制剂LY294002(LY,10 μmol/L)、蛋白激酶C抑制剂GF109203X(GFX,2μmol/L)以及PPARβ/δ的拮抗剂GSK3787(10 μmol/L)处理HepG2细胞,实时定量PCR检测ApoM相关基因表达水平.结果 0、0.25、0.5及1 mmol/L棕榈酸分别作用于HepG2细胞后,ApoM mRNA表达水平显著下降,且呈剂量依赖性(P＜0.01).人胰岛素信号通路PCR芯片检测结果显示,棕榈酸通过其中的6条信号途径影响HepG2细胞的增殖.LY对HepG2细胞ApoM mRNA表达的影响差异无统计学意义(P＞0.05),且LY不能逆转棕榈酸下调HepG2细胞ApoM mRNA的表达.GFX明显降低ApoM mRNA的表达水平(P＜0.05),但GFX不影响棕榈酸降低ApoM mRNA的效应.1mmol/L棕榈酸显著升高HepG2细胞PPARβ/δ mRNA水平(P＜0.001);PPARβ/δ拮抗剂GSK3787对ApoMmRNA表达的影响无统计学意义(P＞0.05);但其能够显著抑制棕榈酸降低HepG2细胞ApoM mRNA的效应(P＜0.05).结论 棕榈酸通过PPARβ/δ途径下调HepG2细胞ApoM基因表达,详细机制还需进一步研究.
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辛伐他汀对急性早幼粒细胞白血病NB4细胞NF-κB信号通路的影响
目的 探讨辛伐他汀对人急性早幼粒细胞白血病细胞株(NB4细胞)增殖与凋亡的影响以及对凋亡信号转导通路NF-κB通路相关基因mRNA表达的影响,以探讨辛伐他汀抗白血病效应及可能机制.方法 以不同浓度辛伐他汀处理NB4细胞,取对数生长期细胞进行实验.实验分为阴性对照组和辛伐他汀处理组(终浓度分别为5、10、15 μmol/L),培养24、48、72 h.采用MTT法观察NB4细胞增殖能力；流式细胞术测定NB4细胞凋亡指标AnnexinⅤ/propidium iodide变化；PCR芯片研究NB4细胞NF-κB通路相关基因mRNA的差异表达.结果 辛伐他汀对NB4细胞的生长有明显抑制作用和促凋亡作用(均P＜0.01),且呈时间与剂量依赖性.15 μmol/L辛伐他汀处理NB4细胞24、48、72 h细胞抑制率分别达到45.75％、92.91％、96.46％,而细胞早期凋亡率分别为30.25％、64.34％、87.38％.与对照组相比,15 μmol/L辛伐他汀处理NB4细胞48 h组中NF-κB通路有56个基因表达发生改变,其中47个基因表达下调、9个基因表达上调.结论 辛伐他汀能抑制NB4细胞增殖并诱导其凋亡,其诱导凋亡机制可能与辛伐他汀调节NF-κB通路相关基因的表达有关.
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血瘀证与NF-κB信号通路相关基因表达相关性的PCR芯片技术分析
目的:探讨血瘀证与NF-κB信号通路相关基因表达的相关性.方法 用高血压病血瘀证患者和非高血压病血瘀证患者血清作用于体外培养的人脐静脉血管内皮细胞,应用NF-κB信号通路PCR芯片技术,观察内皮细胞NF-κB信号通路相关基因表达的变化.结果 在84个NF-κB信号通路相关基因中,高血压病血瘀证组与健康对照组比较,共检测到73个差异基因,其中,54个基因表达上调,19个基因表达下调.有6个上调基因和1个下调基因显示统计学差异(P＜0.05),上调基因包括EGR1、FOS、IKBKG、TLR9、TNFRSF10A、TRADD,下调基因为BCL2A1.非高血压病血瘀证组与健康对照组比较,共检测到71个差异基因,其中,49个基因表达上调,22个基因表达下调.有5个上调基因显示统计学差异(P＜0.05),包括IKBKG、NFKBIA、REL、TLR9、TRADD.可以推测:血瘀证的差异基因为IKBKG、TLR9、TRADD,均为上调基因.结论 血瘀证与NF-B信号通路密切相关,其形成机制与炎症、免疫、凋亡等病理生理过程有关.
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结直肠癌转移相关基因PCR芯片的建立及初步应用
目的 建立同时检测表达多个结直肠癌转移相关基因的PCR芯片,用于诊断结直肠癌转移和预测转移.方法 通过严格设计基因引物,探索各基因同时达到特异性扩增的PCR反廊条件;应用基因芯片筛选获得的29个结直肠癌转移相关基因,结合3个看家基因,建立同时检测32个基因的PCR芯片;应用该芯片检测不同转移潜能的结直肠癌细胞和临床直肠癌组织、癌旁正常粘膜.结果 成功构建同时检测32个基因的PCR芯片,各基因均获得特异性扩增;29个转移相关基因PCR芯片检测结果与基因芯片检测结果的吻合率为86%;PCR芯片检测伴有转移的结直肠原发癌与不伴有转移的结直肠癌组织,结果显示14个基因表达一致,15个基因表达有差异.结论 结肠癌转移PCR芯片结果可靠,可用于预测结直肠癌转移的研究.
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过量氟引起成骨细胞内质网应激信号通路的基因差异表达
目的：观察人成骨细胞在过量氟作用下未折叠蛋白反应（UPR）信号通路的差异基因表达，探索在氟中毒条件下成骨细胞内质网应激的作用。方法体外培养人成骨细胞染氟模型，用不同浓度的氟干预24 h后M T S法检测细胞存活率和流式细胞仪检测细胞凋亡百分率，用UPR信号通路PCR Array芯片检测通路中相关基因表达的情况，并用蛋白免疫印迹法（Western blot）检测蛋白表达。结果在氟化钠浓度为0、5、10、20、40、80 mg/L 时，细胞存活率分别为（100．6785±2．8303）％、（105．3934±2．5384）％、（106．1257±2．0483）％、（77．9773±2．5443）％（与对照组比较 P＜0．05）、（30．2377±0．6327）％（与对照组比较 P＜0．05）。流式细胞仪检测，凋亡率分别为5mg/L组4．8％，10mg/L组13．8％，20mg/L组37．0％，40mg/L组58．9％，80 mg/L组63．2％（P＜0．05）。PCR芯片检测发现1个基因表达下调，14个基因表达上调。Western blot结果显示， BIP、ATF4、CHOP、IRE1均呈现出不同程度的随氟剂量增加蛋白表达逐渐上调。XBP1在NaF 5～20 mg/L表达逐渐增强，在40与80 mg/L时表达减弱。结论氟化钠可以通过PERK和IRE1途径引起成骨细胞内质网应激，并且可以引起成骨细胞凋亡。
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FZD3基因和蛋白在大肠癌中的表达
目的:探讨WNT信号通路受体FZD3mRNA及蛋白在大肠癌细胞及组织中的表达.方法:取正常大肠细胞株CCD18-Co、大肠癌细胞株SW480和SW620,以WNT信号通路PCR芯片筛选大肠癌细胞株中差异性表达的基因,并选择FZD3基因采用Taqman PCR法进行验证其在大肠癌细胞中的高表达,同时比较FZD3蛋白在大肠癌组织、腺瘤组织及癌旁正常组织的表达.结果:与大肠正常细胞株CCD18-Co比较,19个基因在大肠癌细胞株SW480和SW620中表达上调,其中FZD3基因为CCD18-Co的195倍和105倍;验证结果显示,与大肠正常细胞株CCD18-CoFZD3比较,FZD3 mRNA在SW480和SW620细胞株中较中升高820倍和622倍,验证了FZD3mRNA在大肠癌细胞株中的高表达;免疫组化结果显示,FZD3蛋白在大肠癌组织中表达为100％,大肠腺瘤中的表达为88％,而癌旁正常组织中仅为17.5％,与癌旁正常组织相比,FZD3蛋白在大肠癌组织中免疫组化分数高6.6倍(P＜0.01);FZD3蛋白的高表达与肠癌TNM分期显著相关(P＜0.005).结论:FZD3可能在大肠癌的发生、发展中起到潜在癌基因的作用.
