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2,2’,4,4’-四溴联苯醚的肝细胞氧化损伤毒性效应研究
目的 探讨2,2’,4,4’-四溴联苯醚(2,2’,4,4’-tetrabromodiphenyl ether,BDE-47)的L02肝细胞毒性效应.方法 采用CCK8法检测BDE47的肝细胞毒性效应,确定时间-剂量-效应关系.选取3个剂量组:高(80 μmol/L)、中(20 μmol/L)和低剂量(5μmol/L)的BDE-47染毒细胞,同时设立一个空白对照组和一个溶剂对照组,试剂盒检测各剂量组超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、乳酸脱氢酶(LDH)和谷胱甘肽S-转移酶(GST)的表达,SPSS 13.0进行统计分析.结果 BDE-47具有明显的肝细胞毒性(与对照组相比,P＜0.01),染毒时间在12 ～72 h时呈现时间-剂量-效应关系,并发现BDE-47染毒肝细胞12 h的半数抑制浓度为80 μmol/L,为其显著作用时间点；BDE-47染毒L02肝细胞后,细胞外的LDH表达增加,细胞内MDA含量增加；而细胞内GST和SOD酶活力则呈现低浓度BDE47染毒时升高而高浓度时降低.结论 BDE-47对L02肝细胞具有一定的细胞毒性,并能够导致细胞氧化应激损伤.这可能是其生物毒性效应的重要机制之一.
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CNP2线粒体定位信号以及磷酸酯酶活性对抑制HIV-1 Gag蛋白组装作用的影响
目的：研究CNP2在线粒体上的定位以及磷酸酯酶活性是否参与抑制HIV-1病毒颗粒组装。方法采用RT-PCR扩增野生型CNP2编码区，插入到真核表达载体pcDNA5，构建融合蛋白Flag-CNP2的表达质粒pcDNA5-Flag-CNP2。应用融合PCR诱导突变法构建CNP1及CNP2突变表达载体。CNP表达载体分别与HIV-1假病毒包装质粒pLP1、pLP2、pLP/VSVG、pLenti6-EGFP共同瞬时转染293T细胞。集落形成实验检测上清病毒滴度，Western blot检测细胞中Gag蛋白p55、p24以及细胞培养上清中p24的表达情况。结果与对照组比较，CNP2、CNP1、CNP2-S9/22A可以显著抑制细胞中病毒的释放，培养上清中病毒滴度显著降低（滴度分别为5.66、4.20、5.75、6.63 Log10IU/ml，NC组为7.65 Log10 IU/ml；t =58.23、17.24、12.77、6.131，P =0.0035、0.0066、0.0004、0.0039）。CNP1抑制HIV-1病毒颗粒组装作用更强，Western blot检测培养上清中病毒蛋白完全p24消失。磷酸酯酶结构域（2HM）突变后CNP2抑制HIV-1病毒颗粒组装的作用显著降低。结论 CNP2抑制HIV-1病毒颗粒组装需要磷酸酯酶结构域（2HM）的参与，CNP2的线粒体定位信号可能会影响其抑制HIV病毒颗粒组装的作用。
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2,2’,4,4’-四溴联苯醚对人神经母细胞瘤细胞自噬水平的影响
目的 探讨2,2’,4,4’-四溴联苯醚(2,2’,4,4’-tetrabromodiphenyl ethers,PBDE-47)对人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞自噬水平的影响.方法 取对数生长期的SH-SY5Y细胞,分别以终浓度为0(溶剂对照)、1、5、10 μmol/L的PBDE-47染毒处理24h后,采用透射电子显微镜观察细胞内双层膜自噬体结构;以自噬囊泡示踪剂单丹黄酰尸胺(MDC)染色检测自噬囊泡生成情况;采用Western blotting技术检测自噬相关蛋白LC3、Beclin1、P62的表达水平.结果 电镜超微结构观察结果显示,对照组细胞内未见异常变化,1 μmol/L染毒组细胞内可见轻微的线粒体扩张但未见明显的双层膜自噬体结构,5μmol/L染毒组细胞内可见明显的线粒体空泡及双层膜自噬体结构,10 μmol/L染毒组细胞内观察到的双层膜自噬体结构多;与对照组相比,5、10 μmol/L PBDE--47染毒组MDC荧光强度升高,MDC阳性细胞比例增加;此外,5、10 μmol/L PBDE-47染毒组自噬相关蛋白LC3、Beclin1、P62的表达水平与对照组相比均明显升高,且差异具有统计学意义(P＜0.05).结论 PBDE-47可诱导SH-SY5Y细胞自噬水平的增加.
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溶酶体在2,2’,4,4’-四溴联苯醚诱导HepG2细胞凋亡中的作用
[目的]探讨2,2’,4,4’-四溴联苯醚(BDE 47)致人肝癌HepG2细胞凋亡机制. [方法]不同浓度BDE 47(0.00、6.25、12.50、25.00、50.00、100.00 μmol/L)染毒HepG2细胞24h,采用四氮唑盐比色法(MTT法)检测细胞存活率；用2’,7’-二氢二氯荧光素(DCFH-DA)探针检测活性氧水平；用吖啶橙(AO)探针及罗丹明(Rh123)荧光探针分别检测溶酶体膜通透性和线粒体膜电势,并通过溶酶体组织蛋白酶B特异性抑制剂环氧酶琥珀酰肽甲基酯(CA-074)验证溶酶体在BDE 47细胞毒性的作用. [结果]与对照组比较,50.00、100.00 μmol/L BDE 47染毒组HepG2细胞存活率明显降低(P＜0.01)；各BDE47染毒组HepG2细胞凋亡率明显升高(P＜0.01),呈现剂量-效应关系(R2=0.981)；各BDE47染毒组HepG2细胞活性氧含量明显升高(P＜0.01),≥12.50μmol/L BDE 47染毒组HepG2细胞内溶酶体膜通透性明显升高(P＜0.05; P＜0.01),各BDE47染毒组HepG2细胞内线粒体膜电势明显降低(P＜0.01),上述3项指标与染毒浓度均呈剂量-效应关系(R2=0.918,R2=0.636,R2=0.678).25 μmol/L CA-074能够明显干预50 μmol/L BDE 47对细胞的毒性作用使细胞存活率升高,细胞调亡减少(均P＜0.05). [结论]BDE47可能通过溶酶体介导线粒体途径诱导HepG2细胞凋亡.
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3,5,2’,4’-四羟基查尔酮对尿酸诱导高尿酸血症小鼠尿酸排泄的影响研究
目的研究3,5,2’,4’-四羟基查尔酮(P40)对尿酸诱导的高尿酸血症小鼠尿酸排泄的影响,以及对尿酸肾脏转运体葡萄糖转运体9(GLUT9)、尿酸盐转运体1(URAT1)的调控作用。方法昆明种小鼠60只,随机分为正常组、模型组、P402.0、4.0、8.0 mg·kg-1组以及阳性对照组,分别灌胃给予受试药物5次；腹腔注射尿酸(150 mg·kg-1)诱导成高尿酸血症小鼠,磷钨酸法测定血尿酸水平和肝尿酸含量；RT-PCR和Western blot 检测小鼠肾脏GLUT9、URAT1的表达。结果① P40(4．0、8．0 mg·kg-1)剂量组明显降低高尿酸血症小鼠血清尿酸水平,与模型组相比,差异有统计学意义(P<0．05,0．01)；各实验组肝尿酸含量降低,与正常组相比,差异有统计学意义(P<0．01)。② P40各剂量组URAT1基因表达水平无明显变化,蛋白表达水平有下降趋势,但尚未达到统计学意义( P >0．05)。 P40(2．0、4．0、8．0 mg · kg-1)组GLUT9基因表达水平具有下调趋势,但与模型组相比,差异无统计学意义(P>0．05)；P40(4．0、8．0 mg·kg-1)组GLUT9蛋白表达水平明显下降,与模型组相比,差异有统计学意义。结论 P40具有促进高尿酸血症小鼠尿酸排泄的作用,其机制与下调GLUT9的蛋白表达有关。
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5,2',4'-三羟基-6,7,5'-三甲氧基黄酮通过线粒体途径诱导人肝癌HepG-2细胞凋亡
目的 探讨5,2’,4’-三羟基-6,7,5’-三甲氧基黄酮(5,2',4’- trihydroxy -6,7,5 '-trimethoxyflavone,TTF1)诱导人肝癌HepG -2细胞凋亡的诱导作用及机制.方法 TTF1作用HepG -2细胞后,采用流式细胞术测定细胞周期及凋亡率,采用Western blot检测bcl-2、bax、cyt -c、caspase-3和caspase-9蛋白表达.结果 TTF1能够抑制人肝癌HepG -2细胞增殖、诱导凋亡.Western blot结果显示,TTF1明显降低bcl -2 mRNA及蛋白表达,增加bax、胞质cyt -c、caspase-3和caspase-9 mRNA及蛋白表达.结论 TTF1可以通过线粒体途径诱导人肝癌HepG -2细胞发生凋亡.
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2,2’,4,4’-四溴联苯醚对视黄醛受体和雌激素受体的影响
目的:探讨2,2’,4,4’-四溴联苯醚(BDE-47)对视黄醛受体(RXRα)和雌激素受体(ERα、ERβ)的影响,为阐明多溴联苯醚化合物神经内分泌干扰效应提供科学依据.方法:采用CCK-8法测定BDE-47对慢病毒转染技术构建的稳定高表达和低表达RXRα的MCF-7细胞系及正常细胞系的细胞毒性;并以BDE-47分别处理3种细胞,采用TBA法、XOD法及RT-PCR法测定超氧化物歧化酶(SOD)活力、丙二醛(MDA)含量及人类8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶(hOGG1)mRNA表达量,采用RT-PCR和Western blot分析其对3种细胞系RXRα、ERα和ERβ的mRNA及蛋白表达的影响.结果:BDE-47对MCF-7细胞系具有明显的细胞毒性作用,作用24 h时,对RXRα正常表达、高表达和低表达的MCF-7细胞的半数抑制浓度(IC50)分别为23.15、82.78、30.16 μmol/L;BDE-47可造成3种细胞的氧化损伤,RXRα受体高表达细胞对BDE-47的细胞毒性耐受性明显高于另外两种细胞,可一定程度提高细胞抗氧化损伤能力.BDE-47对3种细胞RXRα的表达有明显的抑制作用,可诱导RXRα正常表达与低表达细胞中ERα受体的表达增强、ERβ受体的表达降低;而在RXRα高表达细胞中ERα受体的表达降低、ERβ受体的表达增强,两种雌激素受体表达变化相反.结论:BDE-47可能抑制RXRα受体表达,继而干扰ERα、ERβ两种受体的表达和二者间的平衡,从而发挥其神经内分泌毒性效应.
