基于γH2AX和微核的流式细胞法检测NNK与AαC遗传毒性

目的 探讨烟草特有亚硝胺NNK和杂环胺AαC的遗传毒性,对γH2AX焦点与微核分析结果进行比较.方法 以0、25、50、100、200和400 μg/ml的NNK,0、2.5、5、10、20和40 μg/ml的A αC分别染毒中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)24 h后,采用MTT试验检测细胞存活率,采用流式细胞仪检测NNK和A αC各剂量诱导的γH2AX焦点率和微核率,并比较γH2AX焦点率与微核率的差异.结果 NNK各剂量的γH2AX焦点率分别为:(1.98±0.15)％、(2.28±0.04)％、(2.86±0.13)％、(3.14±0.09)％、(3.88±0.21)％和(4.34±0.20)％.与阴性对照相比,NNK剂量为25 μg/ml时,γH2AX焦点率的差异有统计学意义(P＜0.05).AαC各剂量的γH2AX焦点率分别为:(3.81±0.15)％、(3.24±0.25)％、(3.47±0.21)％、(3.90±0.14)％、(6.12±0.14)％和(11.98±0.24)％.与阴性对照相比,AαC剂量为10 μg/ml时γH2AX焦点率的差异有统计学意义(P＜0.05).NNK各剂量的微核率分别为:(1.50±0.22)％、(1.76±0.44)％、(3.26±0.27)％、(4.01±0.88)％、(7.50±0.70)％和(14.67±1.08)％;与阴性对照相比,NNK剂量为50μg/ml时微核率的差异有统计学意义(P＜0.05).AαC各剂量微核率分别为:(1.42±0.50)％、(1.47 ±0.43)％、(1.42±0.35)％、(1.88±0.15)％、(5.88±1.15)％和(10.67±1.82)％.与阴性对照相比,AαC剂量为20 μg/ml时微核率的差异有统计学意义(P＜0.05).结论 一定剂量的NNK和AαC可以诱发体外遗传毒性;与流式微核方法相比,流式γH2AX方法灵敏度更高.

NNK对V79细胞增殖、凋亡和周期的影响

目的 探讨4-(甲基亚硝氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)对中国仓鼠肺细胞V79的体外毒性作用.方法 采用MTT法检测不同浓度NNK(0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 mg/ml)对V79细胞存活率的影响.流式细胞仪检测不同浓度NNK体外作用24 h对V79细胞凋亡率和周期分布的影响.结果 NNK对V79细胞具有明显的抑制体外增殖作用.MTT结果显示抑制呈时间和浓度的依赖性(P＜0.05).流式细胞仪检测显示,各实验组细胞经NNK作用24 h后,细胞凋亡率分别为27.20％±1.26％、35.91％±1.98％、42.68％±2.27％、49.55％±2.81％和63.18％±3.52％,与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05).细胞周期发生G0/G1阻滞.结论 NNK对V79细胞有明显的增殖抑制作用,其机制可能与诱导和促进细胞凋亡相关.

α粒子和NNK联合生物学作用的初步研究

目的本研究通过建立α粒子和NNK在较低剂量下联合作用体外培养细胞的实验模型,探索二者联合作用诱发细胞的生物学效应,为环境复合作用危害评价及医学防护提供有益线索.

Objective To study the alteration of circulating microRNAs in 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone (NNK)-induced early stage lung carcinogenesis.
Methods A lung cancer model of male F344 rats was induced with systemic NNK and levels of 8 lung cancer-associated miRNAs in whole blood and serum of rats were measured by quantitative RT-PCR of each at weeks 1, 5, 10, and 20 following NNK treatment.
Results No lung cancer was detected in control group and NNK treatment group at week 20 following NNK treatment. The levels of some circulating miRNAs were significantly higher in NNK treatment group than in control group. The miR-210 was down-regulated and the miR-206 was up-regulated in NNK treatment group. The expression level of circulating miRNAs changed from week 1 to week 20 following NNK treatment.
Conclusion The expression level of circulating miRNAs is related to NNK-induced early stage lung carcinogenesis in rats and can therefore serve as its potential indicator.

α粒子和NNK联合作用的细胞遗传毒性

目的研究α粒子和4-甲基亚硝基-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)联合作用的细胞遗传毒性.方法永生化的人支气管上皮细胞(BEP2D细胞)分为正常对照组(NC)、α粒子单纯照射组(α)、NNK染毒组(NNK)、NNK染毒(100 μg/ml)后α粒子照射组(NNK+α)和α粒子照射后NNK染毒(100 μg/ml)组(α+NNK);用单细胞凝胶电泳法检测DNA损伤;用多核细胞法检测细胞次黄嘌呤鸟嘌呤核糖转移酶(HPRT)基因突变率;用细胞遗传学方法检测细胞微核率.结果与相同剂量NNK或α粒子单独作用比较,α粒子和NNK联合作用诱发BEP2D细胞DNA损伤、HPRT基因突变率、以及细胞微核率均显著增高;扣除NNK效应后,α粒子和NNK联合作用诱发BEP2D细胞DNA损伤、HPRT基因突变率、以及细胞微核率也明显高于α粒子单独照射组.结论α粒子合并NNK的细胞遗传毒性具有协同性.

α粒子和NNK联合作用的细胞毒性研究

目的 研究α粒子和NNK联合作用的细胞毒性.方法 指数生长期永生化的人支气管上皮细胞(BEP2D细胞)分为正常对照组(NC)、α粒子单纯照射组(α)、NNK染毒组(NNK)、NNK染毒(100 μg/ml)后α粒子照射组(NNK+α)和α粒子照射后NNK染毒(100 μg/ml)组(α+NNK).用低密度接种细胞的克隆形成率测定细胞存活分数;用分子探针二氯荧光素双乙酸盐(DCFH-DA)和氢化乙啶(HE)检测细胞内活性氧(ROS)水平;通过测定培养液中乳酸脱氢酶(LDH)活性评价细胞膜通透性损伤.结果 与相同剂量NNK或α粒子单独作用比较,α粒子和NNK联合作用BEP2D细胞的存活率明显下降,细胞内ROS水平和细胞培养液中LDH活性显著增高.扣除NNK效应后,α粒子和NNK联合作用BEP2D细胞的存活率明显低于α粒子单独照射组,而细胞内ROS水平和细胞培养液中LDH明显高于α粒子单独照射组.此外还发现α粒子照射后NNK染毒的细胞存活率明显低于NNK染毒后α粒子照射组.结论 α粒子合并NNK的细胞毒作用具有协同性,且两者作用顺序不同对细胞存活率有影响.

基于Luminex液相芯片技术的NNK和AαC体外免疫毒性研究

目的 了解4-(甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶)-1-丁酮(NNK)和2-氨基-9H-吡啶并[2,3-b]吲哚(AαC)的体外免疫毒性特征.方法 分别以0、12.5、25、50、100、150和200 μg/ml NNK染毒小鼠淋巴瘤细胞(EL-4细胞)24 h,以0、2.5、5、7.5、10、12.5和15 μg/ml AαC染毒小鼠巨噬细胞(Ana-1细胞)24 h.采用CCK-8法检测细胞存活率,以Luminex液相芯片技术检测细胞上清液中与免疫相关的20种细胞因子分泌量,以BCA蛋白检测方法校正细胞因子的结果.结果 NNK染毒EL-4细胞后,白介素(IL)-10、IL-17 、IL-1β和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量随染毒剂量的增加而升高,粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)含量随染毒剂量的增加而降低,且均存在剂量-效应关系;碱性成纤维细胞生长因子(FGF-basic)、γ-干扰素(IFN-γ)、IL-1α、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-12、IL-13、干扰素诱导蛋白-10(IP-10)、角质细胞诱导因子(KC)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、γ-干扰素诱导性单核因子趋化因子(MIG)、巨噬细胞炎症蛋白-1α(MIP-1α)和血管内皮生长因子(VEGF)含量无明显变化.AαC染毒Ana-1细胞后,IL-5、MCP-1、MIP-1α、TNF-α和VEGF含量随染毒剂量的增加而降低,其余15种细胞因子无明显变化.结论 NNK和AαC可以产生体外免疫毒性.

NNK抑制ATM基因表达的实验研究

目的:研究烟草致癌物质4-甲基亚硝胺基-1-3-吡啶基-1-丁酮(NNK)在非小细胞肺癌细胞H1299中对ATM基因表达的影响.方法:采用Western Blot的方法检测不同时间段NNK处理的人非小细胞肺癌细胞H1299中ATM蛋白的表达量;构建ATM启动子萤火虫荧光素酶报告基因质粒;用双荧光素酶报告基因系统检测经NNK处理的H1299细胞中ATM启动子的活性.结果:Western Blot证实H1299细胞中,NNK在增加了p-ATM(表明ATM被激活)的同时抑制了ATM蛋白的表达.结论:测序结果显示ATM启动子质粒构建成功;双荧光素酶报告基因检测系统证实了在H1299细胞中NNK抑制ATM启动子的活性,从而抑制ATM基因的表达.

纳米硒对4-甲基亚硝胺-1-(3-吡啶)-1-丁酮诱发昆明小鼠肺癌的防治研究

目的:研究烟草特异亚硝胺4-甲基亚硝胺-1-(3-吡啶)-1-丁酮[4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridy1)-1-butanone,NNK]诱发昆明小鼠发生肺癌及纳米硒对肺癌的防治作用.方法:用单次腹腔注射NNK(500μmol/kg)制成昆明小鼠肺癌模型,观察8个月后肺癌发生率和肺肿瘤灶结节数,并进行病理诊断.在注射NNK后第1、3、7、15和30天测定腹腔巨噬细胞吞噬率、脾抗体生成细胞数和迟发型变态反应等免疫功能指标.结果:注射NNK后8个月,昆明小鼠肺癌发生率为93.3%(28/30),肺肿瘤灶计数为(5.075±2.98)个/肺,病理学诊断为腺癌.NNK处理的小鼠分别饮用含硒0.5、1.0、和3.0 ppm的纳米硒(NS),肺癌发生率和肺肿瘤灶计数分别下降到69.2%(18/26)、56.6%(17/30)、46.7%(14/30)和(2.29±2.23)、(1.37±2.47)、(1.09±1.31)个/肺.在注射NNK后的1个月内,小鼠多种免疫功能出现不同程度的改变,而NS对NNK所致小鼠免疫功能失衡的调节作用明显.结论:NS对NNK诱发小鼠肺癌有明显防治作用,并有较好的剂量效应关系,其机理可能与硒的免疫调节作用有关.

人支气管上皮细胞恶性转化过程中染色体畸变的研究

目的:研究在烟草特异性亚硝胺(NNK)诱发人支气管上皮细胞(BEAS-2B)恶性转化过程中染色体畸变,探讨其在吸烟高危人群罹患肺癌预警及普查方面的意义.方法用NNK诱发BEAS-2B细胞(BEAS-2BNNK)恶性转化,并在此过程中用常规中期染色体分析方法,动态观察染色体畸变的情况.结果:1.NNK诱发BEAS-2B细胞恶性转化模型的建立①BEAS-2BNNK(实验组)第5代细胞血清抗性显著增强.②第15代BEAS-2BNNK细胞具有锚着独立性生长特性.③第20代BEAS-2BNNK细胞超微结构出现明显异型性.④第25代BEAS-2BNNK细胞在裸鼠体内成瘤,病理为高分化鳞形细胞癌.2.染色体畸变①BEAS-2B(对照组)二倍体细胞占细胞总数的91%～97%,传代后核型稳定;从第5代开始BEAS-2BNNK细胞即逐渐失去正常核型,随着传代次数增加,二倍体细胞比例从83%递减至54%,异倍体及多倍体细胞呈递增趋势,较对照组明显增高.②各代BEAS-2B细胞结构畸变发生率为2%～4%;除第5代BEAS-2BNNK细胞结构畸变总频率(11%)明显高于BEAS-2B细胞外,其余各代细胞与BEAS-2B细胞相近.结论:NNK能成功诱发人支气管上皮细胞(BEAS-2B)细胞恶性转化,为进一步探讨肺癌发生机制、尤其是吸烟致肺癌发生机制提供了理想模型.染色体的异倍性和多倍性在NNK诱发BEAS-2B细胞转化成肺癌过程中可能属早期事件,有望成为吸烟高危人群罹患肺癌的预警及普查指标之一.

遗传毒性致癌物NNK致癌强度T25的推导

目的 采用简单易行的T25来表达NNK的致癌强度,使量化风险评估易于操作.方法 通过计算机检索、收集国内外1988-2018年间公开发表的关于NNK慢性毒性的研究文献,筛选证据清晰的文献资料,对文献的原始数据进行整理分析,找出临界剂量,通过简单的数学计算,推导出实验动物的T25,并通过系数转换为人的HT25.结果 适合于评估NNK的HT25有两篇关键文献,其HT25分别是0.02 mg/(kg·d)和0.004 mg/(kg·d),选择相对保守的0.004mg/(kg·d).结论 T25作为遗传毒性致癌物的致癌强度更为简单易行.

人支气管上皮细胞恶性转化过程中FHIT蛋白表达的研究

背景与目的目前大多数研究者分别研究了正常支气管上皮、癌前病变及肺癌组织(吸烟或不吸烟者)标本FHIT蛋白表达,而没有在肺癌发生发展过程中研究其表达及意义.本研究的目的是在烟草特异性亚硝胺(NNK)诱发人支气管上皮细胞(BEAS-2B)恶性转化过程中,探讨FHIT蛋白表达的变化及其意义.方法用500 mg/L NNK诱发BEAS-2B细胞(对照组)恶性转化为BEAS-2BNNK细胞(实验组),并在此过程中用免疫细胞化学方法动态观察FHIT蛋白表达的情况.结果(一)NNK诱发BEAS-2B细胞恶性转化模型的建立:①第5代BEAS-2BNNK细胞血清抗性显著增强;②第15代BEAS-2BNNK细胞具有锚着独立性生长特性(软琼脂克隆形成);③第20代BEAS-2BNNK细胞超微结构出现明显异型性;④第25代BEAS-2BNNK细胞在裸鼠体内成瘤,病理类型为高分化鳞癌.(二)FHIT蛋白表达:BEAS-2B细胞FHIT蛋白表达稳定,在各代之间的差异无统计学意义(P＞0.05);第5代BEAS-2BNNK细胞FHIT蛋白表达即有所降低,并随传代次数增加而进行性下降,但第25代细胞FHIT蛋白却呈高表达.结论①500 mg/L NNK能成功诱发BEAS-2B细胞恶性转化,为进一步探讨肺癌尤其是吸烟致肺癌的发生机制提供了理想模型.②FHIT蛋白表达减弱在肺癌发生过程中可能属早期事件,但FHIT蛋白在细胞恶性转化晚期上调表达值得进一步研究.

烟草致癌原NNK诱发大鼠肺癌前病变的实验研究

背景与目的4-(甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶)-1-丁酮[4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone,NNK]是烟草中主要的致癌原.为了研究NNK的致癌机制,寻找针对NNK所致肺癌的有效的化学防护措施,建立以NNK诱发的动物模型是非常有效的研究手段.本研究的目的是观察一次性支气管灌注NNK致Wistar大鼠的肺组织的病理变化,并探讨病变发生机制.方法实验组Wistar大鼠15只,左肺叶下部支气管内灌注含NNK 50 mg/kg(高剂量组,5只)或25 mg/kg(低剂量组,10只)的碘油溶液0.1 mL,X线影像学监测病变进展.另15只Wistar大鼠灌注不含NNK的碘油,作为对照.HE染色观察大鼠肺组织病理变化,免疫组化SP法检测AE1/AE3、PCNA、p53蛋白表达.结果灌注碘油后数字减影血管造影(digital subtraction angiography,DSA)显示碘油分布于大鼠左肺叶下部,第107天DSA显示左肺叶下部的碘油影像消失.实验组67%(10/15)的大鼠(高剂量组4只,低剂量组6只)左肺下部见绿豆大小的结节状实变病灶.HE染色示实验组100%(15/15)的大鼠左肺组织出现局灶性肺泡细胞的不典型增生,肺泡间隔增宽,肺泡腔狭窄;67%(10/15)的大鼠左肺有腺上皮的高度不典型增生,部分增生的细胞构成小腺体,偶见异型增生腺体向支气管壁的肌层侵犯.免疫组化染色显示实验组不典型增生细胞的角蛋白AE1/AE3阳性.PCNA在对照组和NNK低、高剂量组的阳性表达率分别为13%(2/15)、90%(9/10)、100%(5/5),后两者与对照组的差异均有统计学意义(P=0.000,P=0.001),而低、高剂量组之间差异无统计学意义(P=1.000).p53蛋白在对照组肺组织中表达为阴性,在NNK低、高剂量组中表达率分别为50%(5/10)和60%(3/5),均较对照组明显升高(P=0.005,P=0.009),而低、高剂量组之间差异无统计学意义(P=1.000).结论对Wistar大鼠的左肺叶支气管灌注含NNK的碘油溶液可在局部诱发肺泡细胞和腺上皮的不典型增生.该模型可用于烟草致肺癌的实验研究.