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α-粒子辐射诱导BEP2D细胞系的差异蛋白质组研究
目的:建立一个全面的肺癌细胞系蛋白质组表达谱.方法:利用固相pH梯度等电聚焦双向电泳、新生物质谱肽质量指纹谱和源后衰变技术以及生物信息学技术,对RH细胞系原代、20代、35代细胞进行功能蛋白组分析.结果:获得了RH细胞系原代、20代和35代蛋白表达谱.凝胶图象分析显示3个蛋白质点只在原代中表达.原代到20代细胞共43个蛋白质表达量发生变化,其中21个蛋白质表达量上升,22个下降;20代到35代细胞共66个蛋白质发生表达量变化,其中13个蛋白质的表达量上升,53个下降.质谱鉴定出40个蛋白质点,共获得7个差异表达蛋白质信息,其中HMG-1在RH0细胞内表达,而RH20和RH35细胞内不表达,Maspin在癌前阶段表达量下降,来源于肿瘤抑制基因区的氨酰酶1和5'甲硫酰苷磷酸化酶也在不同时期表达下降.结论:这些差异表达的、有或无的蛋白质,可能与肺癌的发生、发展和恶变存在一定关系.
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α粒子和NNK联合作用的细胞遗传毒性
目的研究α粒子和4-甲基亚硝基-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)联合作用的细胞遗传毒性.方法永生化的人支气管上皮细胞(BEP2D细胞)分为正常对照组(NC)、α粒子单纯照射组(α)、NNK染毒组(NNK)、NNK染毒(100 μg/ml)后α粒子照射组(NNK+α)和α粒子照射后NNK染毒(100 μg/ml)组(α+NNK);用单细胞凝胶电泳法检测DNA损伤;用多核细胞法检测细胞次黄嘌呤鸟嘌呤核糖转移酶(HPRT)基因突变率;用细胞遗传学方法检测细胞微核率.结果与相同剂量NNK或α粒子单独作用比较,α粒子和NNK联合作用诱发BEP2D细胞DNA损伤、HPRT基因突变率、以及细胞微核率均显著增高;扣除NNK效应后,α粒子和NNK联合作用诱发BEP2D细胞DNA损伤、HPRT基因突变率、以及细胞微核率也明显高于α粒子单独照射组.结论α粒子合并NNK的细胞遗传毒性具有协同性.
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α粒子和NNK联合作用的细胞毒性研究
目的 研究α粒子和NNK联合作用的细胞毒性.方法 指数生长期永生化的人支气管上皮细胞(BEP2D细胞)分为正常对照组(NC)、α粒子单纯照射组(α)、NNK染毒组(NNK)、NNK染毒(100 μg/ml)后α粒子照射组(NNK+α)和α粒子照射后NNK染毒(100 μg/ml)组(α+NNK).用低密度接种细胞的克隆形成率测定细胞存活分数;用分子探针二氯荧光素双乙酸盐(DCFH-DA)和氢化乙啶(HE)检测细胞内活性氧(ROS)水平;通过测定培养液中乳酸脱氢酶(LDH)活性评价细胞膜通透性损伤.结果 与相同剂量NNK或α粒子单独作用比较,α粒子和NNK联合作用BEP2D细胞的存活率明显下降,细胞内ROS水平和细胞培养液中LDH活性显著增高.扣除NNK效应后,α粒子和NNK联合作用BEP2D细胞的存活率明显低于α粒子单独照射组,而细胞内ROS水平和细胞培养液中LDH明显高于α粒子单独照射组.此外还发现α粒子照射后NNK染毒的细胞存活率明显低于NNK染毒后α粒子照射组.结论 α粒子合并NNK的细胞毒作用具有协同性,且两者作用顺序不同对细胞存活率有影响.
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α粒子诱发永生化人支气管上皮细胞恶性转化过程中DNA甲基化的变化
目的 分析α粒子辐射诱发永生化人支气管上皮细胞恶性转化过程中DNA甲基化谱的变化.方法 分别提取α粒子诱发永生化人支气管上皮恶性转化细胞BERP35T4和对照细胞BEP2D的基因组DNA,用非甲基化敏感酶MseI对基因组DNA进行酶切,然后在酶解后的片段两端连接上连接臂,再用甲基化敏感内切酶进行消化,终消化产物进行PCR扩增和荧光标记,后与甲基化芯片进行杂交.杂交结果进行扫描,并对芯片图像进行分析,对芯片上的数据进行归一化处理,后以差异倍数为1.5的标准来确定差异表达基因.结果 α粒子辐射诱发永生化人支气管上皮细胞恶性转化后,有16个基因发生了甲基化的改变,其中,甲基化上调基因有9个,下调基因7个.鞘氨酸激酶SKIP,蛋白质磷酸酶PPP3CC,蛋白激酶MAP2K6,杀伤细胞免疫球蛋白受体KIR2DLI、KIR2DL4、KIR3DP1,锌指蛋白ZNF493、ZNF100,转录因子NKX2-5、TFAP2D、DR1,钾离子通道KCNJ16,肉瘤抗原CCDC18,以及甘油甲酸酯结合蛋白FNBP1L、同源异形蛋白IRX4、HSF蛋白片段EPB41L3、TCP10蛋白等都发生了甲基化改变.结论 证实了电离辐射能够通过改变细胞的表观遗传修饰而在肿瘤发生中发挥一定的作用.
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肺癌诊断基因的初步筛选
目的筛选肺癌细胞恶性转化不同时期差异表达的基因,以期用于肺癌的诊断.方法应用抑制消减杂交技术(SSH)、测序、cDNA芯片(cDNA Microarray)、northern blot.结果利用SSH建立了永生化人支气管上皮细胞(BEP2D)恶性转化不同时期差异表达基因的cDNA文库,其中,A消减文库(BEP2D细胞的cDNA为tester,α粒子照射BEP2D细胞后35代恶性转化细胞R15Hp35的cDNA为driver)有416个克隆,B消减文库(α粒子照射BEP2D细胞后20代转化细胞R15Hp20的cDNA为tester,BEP2D和R15Hp35细胞的cDNA混合后为driver)有301个克隆,C消减文库(R15Hp35细胞的cDNA为tester,BEP2D细胞的cDNA为driver)有586个克隆.对文库中107个克隆单向测序发现:19个克隆在GenBank中没有查到对应的同源序列,其它88个克隆共代表了76个不同的已知基因.然后,将3个文库中全部克隆的cDNA制作成cDNA芯片,用该芯片筛选了15例肺癌组织、5例肺癌旁组织和其他8种癌组织(肝癌、胃癌、食管癌、乳腺癌、白血病、子宫内膜癌、脑神经角质瘤和结肠癌)中mRNA的表达差异.结果,获得肺癌组织高于肺癌旁组织表达的cDNA 26个,肺癌旁组织高于肺癌组织表达的31个,2者高于其他8种癌组织的分别为:肺癌旁组织中63个,肺癌组织中87个.将这208个具较大差异表达的基因重新制作成cDNA芯片,再选用临床上同一鳞癌病人鳞癌和鳞癌癌旁组织各1例与该芯片杂交,发现这些筛选出的基因的确在癌组织和癌旁组织中存在较大差异.结论这些初步筛选出的差异表达基因有望成为肺癌诊断的侯选基因.
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BEP2D细胞恶性转化过程中Smad7基因对MAPK信号通路的调控
背景与目的:Smad7基因是转化生长因子(transforming grouth factor-β,TGF-β)信号通路的抑制分子,有研究表明TGF-β通过活化SMAD通路和ras/MEK/ERK通路来诱导某些基因的表达.本研究旨在探讨在人永生化支气管上皮细胞BEP2D经辐射诱发恶性转化过程中,作为SMAD蛋白家族的抑制分子Smad7是否参与TGF-β对MAPK信号通路的调控.方法:将人工合成的Smad7 siRNA及Smad7真核表达载体与pTet-Elk,pTet-Jun反式激活载体、报告基因荧光素酶共转染BEP2D细胞,TGF-β刺激,通过报告基因荧光素酶的表达丰度来检测Smad7对MAPK信号通路的调控.结果:永生化BEP2D细胞中,TGF-β刺激之后,Elk和Jun磷酸化活性升高(PElk=0.033,PJun=0.016);Elk或Jun同Smad7真核表达载体共转染之后,Elk磷酸化活性升高,Jun磷酸化活性降低(PElk=0.017,PJun=0.028);Elk或Jun同Smad7-siRNA共转染之后,Elk磷酸化活性降低,Jun磷酸化活性升高(PElk=0.018,PJun=0.005).恶性化BERP35T2细胞中,TGF-β刺激之后,Elk磷酸化活性增强(P=0.006),Elk同Smad7 siRNA共转染之后,Elk磷酸化活性降低(P=0.000);恶性化细胞中几乎检测不到Jun的活性.结论:在BEP2D细胞发生恶性转化过程中,Smad7基因干预MAPK信号通路,使ERK和JNK磷酸化活性的平衡失调,导致促增殖作用强于生长抑制作用,从而有助于细胞向恶性方向发展.
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α粒子诱发 BEP2D细胞转化过程中肺癌相关基因表达的 cDNA Microarray研究
目的：探讨辐射诱发人支气管上皮细胞 (BEP2D)转化过程中肺癌相关基因的表达。方法：用 Cartesian PixSys5500 cDNA Microarray点样仪将 60个肺癌相关基因以微阵列形式点布于醛基化的玻璃片上。提取α离子辐射前 BEP2D细胞（原代）和α粒子辐射后 20代、 35代细胞总 RNA，经长片段反转录和线性扩增标记成荧光探针后与微阵列中 cDNA进行杂交。结果：原代细胞中检测到 40个基因表达； 20代检测到 47个基因表达； 35代检测到 20个基因表达。所检测的基因中，抑癌基因的 mRNA丰度在原代和 20代后细胞中急剧下降；大多数癌基因的表达丰度在 20代以后细胞中仅轻微下降；生长因子类基因大都在 20代细胞表达。结论：在辐射诱发的人支气管上皮转化细胞中，抑癌基因的失活可能与细胞恶化有关；癌基因及生长因子类基因可能促进了细胞的转化。
关键词： cDNAMicroarray BEP2D细胞 基因表达谱 -
SAGE方法分析永生化BEP2D细胞及α粒子诱发恶性转化BEP2D细胞的基因表达
目的：采用基因表达系列分析（serialanalysisofgeneexpression,SAGE）方法，分析永生化BEP2D细胞及α粒子诱发恶性转化BEP2D细胞的基因表达。方法：细胞培养,收获永生化BEP2D细胞及α粒子诱发恶性转化BEP2D细胞;提取细胞总RNA,分离mRNA,合成生物素标记的双链cDNA;采用SAGE方法获取标签序列，结合UniGene文库分析标签代表的转录本，终通过SAGE软件分析标签丰度，比较两组细胞基因表达差异。选取SAGE实验得到的在两组细胞中表达的已知基因Smad7和CCR11，以RTPCR方法制备探针，用两组细胞等量总RNA为样本，做Northernblot杂交。结果：建立了2个独立的SAGE文库。一个是1.5Gyα粒子照射诱发恶性转化BEP2D细胞的SAGE文库，一个是永生化BEP2D细胞SAGE文库。从2个文库中分别挑取克隆53个、50个，进行测序，测序一共得到总标签2331个，代表单一转录本252个，有70％的SAGE标签可找到与之一一对应的基因，有84个核糖体蛋白基因，约占33％；有12个转录本（4.8％）找不到与之理想匹配的已知基因；2个SAGE文库间，大多数基因表达丰度相近。对2个SAGE文库进行比较发现有在永生化细胞中高表达的基因，也有在恶转细胞中高表达的基因。Northernblot杂交证实SAGE方法得到的TGFβ诱导的Smad7基因在恶转BEP2D细胞中表达略高，化学激活物受体CCR11基因在永生化BEP2D细胞高表达。结论：（1）现有SAGE结果给出两组细胞基因表达丰度及表达差异的趋势。（2）SAGE方法结合Northernblot杂交，证实TGFβ诱导的Smad7基因在恶转BEP2D细胞中表达略高，化学激活物受体CCR11基因在永生化BEP2D细胞高表达。提示Smad7基因参与细胞恶转，CCR11基因对维持细胞正常生长有作用。（3）SAGE方法同时定量比较两组或两组以上mRNA间基因表达水平,简便、快捷，尤其适于筛查已知基因的新功能。
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AnnexinI在α粒子转化细胞及肺癌组织中高表达
目的:探讨AnnexinI表达与肺癌及细胞转化的关系.方法:Western印迹、Northern印迹检测永生化人支气管上皮BEP2D细胞及α粒子照射转化后BEP2D细胞中AnnexinI在mRNA和蛋白质水平的表达,细胞免疫化学检测AnnexinI在BEP2D细胞中的分布.Western印迹检测肺癌病人正常组织与肿瘤组织中AnnexinI蛋白质的表达.结果:AnnexinI在α粒子照射转化后BEP2D细胞中mRNA和蛋白质水平上的表达光密度均为永生化人支气管上皮BEP2D细胞的1.5倍;AnnexinI在BEP2D细胞中分布于胞浆及细胞膜.本研究收集了8例肺鳞癌、4例肺腺癌病人的肺肿瘤组织及正常组织,AnnexinI在肺癌组织中的表达明显高于正常组织(P<0.01),AnnexinI在肿瘤组织中表达的光密度与正常肺组织之比为2.7.结论:AnnexinI在肺癌组织过表达,表明AnnexinI可能与肺癌及细胞恶性转化的发生发展有关.永生化及α粒子照射恶转BEP2D细胞为进一步研究AnnexinI在恶性转化中的作用提供了良好的模型.
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卷烟烟气对细胞线粒体氧化损伤的研究
目的 研究卷烟烟气凝集物(cigarette smoke condensate,CSC)对人乳头状病毒永生化的人支气管上皮细胞(human papillomavirus-immortalized human bronchial epithelial cell line,BEP2D) 线粒体的氧化损伤.方法 采用分子探针2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐(2',7'-dichlorofluorescein diacetate,DCFH-DA) 和氢化乙啶(hydroethidine,HE)检测细胞内活性氧( reactive oxygen species,ROS)水平;用荧光标记物 MCB(Monochlorobimane)、壬基吖啶橙(nonyl acridine orange,NAO)、四氯四乙基苯并咪唑基羰花青碘化物(5,5',6,6'-tetrachloro-1,1',3,3'-tetrethyl benzimidalyl carbocyanine iodide,JC-1) 检测细胞内还原型谷胱甘肽 (glutathione,GSH)及线粒体内膜心磷脂(cardiolipin,CL)、膜电位(mitochondrial membrane poten-tial,△ψm).结果 CSC作用BEP2D细胞后,细胞内ROS显著增加,GSH及线粒体 CL、△ψm水平明显下降,并呈现较好的剂量效应关系.结论 CSC可造成细胞线粒体氧化损伤.
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α粒子诱发人支气管上皮细胞恶性转化不同时期差异表达基因cDNA文库的构建
目的: 建立α粒子诱发人支气管上皮细胞恶性转化不同时期差异表达基因的文库.方法:抑制消减杂交法(SSH).结果:建立了3个人支气管上皮细胞恶性转化不同时期差异表达基因的cDNA文库.其中,A差减文库(永生化人支气管上皮细胞BEP2D的cDNA为tester,α粒子照射BEP2D细胞后35代恶性转化细胞R15Hp35的cDNA为driver)有416个克隆,B差减文库(α粒子照射BEP2D细胞后20代转化细胞R15Hp20的cDNA为tester,BEP2D和R15Hp35细胞的cDNA混合后为driver) 有301个克隆,C差减文库(R15Hp35细胞的cDNA为tester,BEP2D细胞的cDNA为driver)有586个克隆.,对文库中70个cDNA克隆单向测序后发现:61个cDNA为己知基因,9个cDNA在GenBank中无法查到对应的同源序列,可能代表了新基因.结论:3个差减文库的cDNA可能代表了α粒子诱发人支气管上皮细胞恶性转化不同时期差异表达的基因,此为进一步研究α粒子诱导肺癌发生的分子机制奠定了基础.
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α粒子诱发转化人支气管上皮细胞系BEP2D中XRCC5等基因的突变检测
目的与方法:用聚合酶链式反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)方法观察α粒子诱发人支气管上皮细胞系BEP2D细胞转化过程中相关基因的改变.结果:细胞转化过程中,双链断裂修复基因XRCC5发生碱基突变,改变从转化早期过程就持续存在;而p16基因exon2和hMSH2基因exon12未见变化.结论:XRCC5基因在α粒子照射后早期发生突变,使细胞丧失修复双链断裂损伤的能力,是α粒子诱发支气管上皮细胞转化过程中的启动事件之一.
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γ射线辐照对BEP2D细胞蛋白质组的影响
目的:利用蛋白质组学方法,研究与人永生化支气管上皮细胞(BEP2D细胞)辐照相关的差异蛋白质,寻找辐射致肺癌早期诊断和治疗的新指标.方法:分别培养并收集了0、1.5和3.0 Gy γ射线辐照24 h后的BEP2 D细胞样品,用双向凝胶电泳技术分离照射组与对照组细胞样品中的总蛋白质,应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)得到相应的肽质量指纹图,并终鉴定差异蛋白质.结果:质谱鉴定获得10张肽质量指纹图,经数据库搜索后8个蛋白点被初步鉴定(2个蛋白点无结果),其中1个蛋白点重复.用Mascot软件查询NCBInr数据库初步鉴定出7种差异表达的蛋白质,即亲环素A、肌球蛋白轻链2、细胞角蛋白9、α-烯醇酶、磷酸丙糖异构酶1、Makorin环指蛋白1、c-myc启动子结合蛋白1.结论:所鉴定的7种蛋白与辐射诱导肺癌的发生、发展过程密切相关,为寻找辐射致肺癌早期诊断和治疗的新靶点提供了理论依据.
