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应用流式细胞技术检测不同方法处理的脾组织CD3含量
流式细胞技术因操作简便、重复性好、结果可靠,已在免疫学和分子生物学等研究中得到广泛的应用.但流式细胞技术要求标本必须在短时间内新鲜制备,并快速标记抗体,这不利于大批量标本的流式细胞技术测定.本文应用流式细胞仪分别测定液氮速冻脾组织和新鲜脾组织中T淋巴细胞(CD3)的含量,旨在探讨能否应用流式细胞仪对液氮速冻组织进行细胞免疫与分子生物学研究.
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放、化疗前后大肠癌组织端粒酶活性检测临床研究价值
对象与方法1.标本来源:标本取材于2000年1月～2004年12月云南省第一人民医院消化科内镜活检及外科手术切除的新鲜标本.其中,治疗前大肠癌组织标本105例均通过内镜取材,经病理诊断证实;全身化疗(34例)、放疗(30例)后大肠癌组织标本仍通过内镜取材;局部化疗(41例)后及同一病人远癌切端(癌旁10 cm)肉眼观察的正常组织41例(作为正常对照)均取自手术切除标本.标本离体后经冷生理盐水冲洗去污,15～30 min内取材,液氮速冻后转至-80 ℃低温冰箱储存备用.
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肺纤维化大鼠肺组织转化生长因子β1和前胶原基因的表达
急性肺泡炎是肺纤维化病变基础，在肺泡炎形成过程中涉及炎性细胞、免疫效应细胞和细胞因子。体外试验证明肿瘤坏死因子α(TNF-α)、转化生长因子β1（TGF-β1）可上调人胚肺成纤维细胞前胶原mRNA的表达［1，2］,提示急性肺泡炎时这些细胞因子与肺纤维化发生有一定的因果关系。我们用博莱霉素A5诱发大鼠肺纤维化，并制成动物模型,对大鼠肺组织中TGF-β1,前胶原Ⅰ和前胶原 Ⅲ的mRNA进行观察，以探讨它们与大鼠肺纤维化的关系。 一、材料与方法 1. 动物与动物模型: 25只 Wistar雄性大鼠，体重140～170 g，购自中国医学科学院动物中心。将大鼠随机分为5组,每组5只。以乙醚麻醉大鼠，其中1组为正常对照组经气管内一次性灌注生理盐水；其余各组经气管内一次性灌注博莱霉素A5 5 mg/kg，博莱霉素3 d组,7 d组,14 d组,30 d组。于灌注后3、7、14、30 d处死大鼠，取右侧肺液氮速冻待检，左侧肺于100 g/L的中性甲醛液中固定，HE染色。 2.分子杂交及材料来源：分子杂交按参考文献［3］介绍的方法进行。cDNA 探针片段由北京阜外心血管病医院杨方博士惠赠，此片段是由含编码人的前胶原Ⅰ和前胶原Ⅲ重组质粒菌种PH CAL1 TU，PHFS3 中提取的；TGF-β1 cDNA片段由北京市肿瘤研究所高崇峰提供，β-肌动蛋白（β-actin）cDNA 片段购自中山生物技术公司。
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急性髓系白血病细胞端粒酶活性与疗效关系的初步研究
我们采用端粒重复序列扩增法-酶联免疫吸附试验(TRAP-ELISA)和聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)-银染法检测了正常组织和急性髓系白血病(AML)患者治疗前后骨髓细胞的端粒酶活性变化，以探讨其临床意义。对象和方法1 对象选择初发未治AML患者32例，按国内诊断标准［1］确诊，其中男22例，女10 例，年龄16～67岁, 中位年龄32.9岁。M01例，M14例，M212例（M2a10例，M 2b2例），M3a4例，M43例，M58例（M5a1例，M5b7例）。M3 患者用全反式维甲酸 40～60?mg/d治疗至完全缓解(CR)，获CR后用HA（高三尖杉酯碱+阿糖胞苷）方案治疗；其余患者用DA（柔红霉素+阿糖胞苷）或HA方案诱导，缓解后用AA（阿克拉霉素+阿糖胞苷）+足叶乙甙方案。经1～2个疗程后该组患者获骨髓缓解 20例。非血液病患者(包括肝炎、系统性红斑狼疮)及正常志愿者9名作为对照。2 试剂端粒酶PCR-ELISA试剂盒购自德国Boehringer Mannheim公司，阳性对照为人胚肾 293细胞株(试剂盒提供)，阴性对照为端粒酶提取物加1?μg/μl RNase A，37?℃孵育 20 min。3 端粒酶活性检测3.1 标本留取:初发未治患者在初诊时、骨髓缓解患者在化疗后第14天各取骨髓2～3?ml，肝素抗凝，Ficoll分离单个核细胞，初治组白血病细胞含量大于0.70，锥虫蓝染色拒染率大于95 %，PBS洗涤2次，保存于-70?℃待用。正常组织（膀胱、胃、肺组织）30份，均由本院外科提供，标本均取于离体后1?h内，液氮速冻后保存于-70?℃待用。3.2 端粒酶提取物提取：每份实体组织取标本量100?mg，用液氮速冻后在研钵中研成粉末，转至洁净管中，加入200?μl裂解液；每份单个核细胞直接加入200?μl裂解液。充分混匀， ?4℃裂解30?min，16?000×g离心10?min，小心地将上清(约150?μl )移至另一洁净管中，-70?℃保存备用或即用。紫外吸收法测定蛋白质含量。3.3 TRAP-PCR-ELISA：取上述提取液5～20?μl (蛋白质含量10?μg)加入25?μl TRAP-PC R扩增液，用无菌DEPC水补充至50?μl，加40?μl石蜡油覆盖，在PCR仪上扩增：25?℃延伸30?min；94?℃灭活5?min；扩增反应：94?℃ 30?s，50?℃ 30?s，72?℃ 90?s ，循环30次；72?℃延伸10?min。取上述PCR产物5?μl加变性液20?μl混匀，置室温10 ?min，加入225?μl杂交液(含地高辛标记的探针)，混匀后取出100?μl包被于抗生物素的酶标板中,20?℃作用2?h，加入过氧化物酶并与TMB底物显色30?min，在时间分辨荧光仪（WALLAC公司）测定波长为450?nm和690?nm A值,差值△A(A450-A6 90)代表细胞端粒酶活性。3.4 PAGE-银染：取PCR产物45?μl，加氯仿∶异戊醇(24∶1)60?μl混匀，5?000?r/min离心5?min后将上清液小心移至另一0.5?ml洁净管中，加3?mol/L醋酸钠5?μl和无水乙醇3 00?μl，混匀置-20?℃冰箱过夜，再离心，吸掉无水乙醇，在室温下风干，加5～10?μl 去离子水溶解，加上样缓冲液，经120?g/L非变性PAGE，凝胶用体积分数为10%的乙醇固定5 ?min，体积分数为1%的硝酸浸胶5?min，在染色液中染色10?min，用显色液洗2次，醋酸终止反应，制膜干燥保存。用凝胶成像分析仪摄影。4 统计学处理采用SPSS 9.0统计软件包进行t检验。
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生殖器脱垂的年轻患者细胞外基质胶原蛋白浓度低下
生殖器脱垂是阴道旁组织对周围器官的抗拉力丧失所致.阴道黏膜下组织主要由细胞外基质(ECM)组成,除年龄外,内在的体质因素也影响ECM的重组,本研究通过比较生殖器脱垂患者和同龄对照组的盆腔组织的ECM中胶原蛋白的浓度和经胃蛋白酶消化的可提取性,旨在探讨导致生殖器脱垂的体质因素.选取因生殖器脱垂而行手术治疗的22例患者为研究对象,因妇科良性疾患而手术的13例同龄患者为对照,于尿道口外侧6～8mm处切开阴道黏膜,咬取6mm宽10mm深的尿道旁韧带组织块,放入液氮速冻后置-60℃保存.活检组织经0.5M HAc抽提和胃蛋白酶消化后,以6M盐酸溶解,测定羟脯氨酸的量来监测标本的胶原蛋白的浓度和经胃蛋白酶消化后可提取的百分比.随机选研究对象和对照各1例,年龄分别为49岁和50岁,各取活检组织进行福尔马林固定、切片和HE染色.
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NOS阳性细胞在大鼠和小鼠睾丸内分布的比较
1 材料和方法选用雄性Waster大鼠8只,体重210±10 g,雄性昆明小鼠8只,体重22.1±2 g.4%水合氯醛(60 mg/kg)腹膜腔麻醉,经左心室灌注0.9%NaCl冲洗血液,4%多聚甲醛(2500 ml/kg)固定,取睾丸,后固定8 h,30%蔗糖过夜(4℃).液氮速冻后进行冰冻冠状切片,片厚30μm,裱于铬钒明胶片上.应用改进NADPH-d黄递酶组织化学方法进行NOS组织化学反应,常规脱水、透明、封片,光镜观察,每只动物随机选取10个高倍视野,将10个高倍视野的细胞数之和除以10,做为该只动物的NOS阳性细胞数,进行t检验.
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端粒酶hTR和hTERT mRNA在尖锐湿疣组织中的表达
我们应用RT-PCR法检测了尖锐湿疣组织中端粒酶RNA(hTR)和端粒酶催化亚单位(hTERT)mRNA的表达.一、资料与方法1.临床资料:43例尖锐湿疣患者标本为实验组,其中男25例,女18例;年龄17～59岁,平均32.7岁;病程26～190d,平均59.6 d.所有患者均来自2004年1-8月我院皮肤性病科门诊.临床表现典型,病理诊断明确.对照组为21例切除的正常成年男性包皮.所取新鲜的尖锐湿疣组织和正常组织均经液氮速冻,于-80℃保存备用.
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超氧化物歧化酶在基底细胞癌和鳞状细胞癌发病中的意义
我们采用逆转录聚合酶链反应 (RT－ PCR)和免疫印迹技术研究了正常暴光、非暴光部位皮肤和皮肤癌、癌周正常组织中锰 SOD(MnSOD) 和铜锌 SOD(CuZnSOD)的 mRNA及蛋白表达，初步探讨其表达在皮肤癌发生中的意义。 一、材料与方法 材料：基底细胞癌 (BCC)6例，鳞状细胞癌 (SCC)6例，皆发生于头面部，皮肤癌组织及癌周正常皮肤组织取材（均经组织学证实）。暴光、非暴光部位皮肤各 5例为正常对照，来源于上海第二医科大学第九医院整形外科。标本以液氮速冻，－ 80℃保存。 RNA抽提试剂盒购自 Gibcol BRL公司， RT－ PCR试剂盒购自 Promega公司，兔抗人 MnSOD、 CuZnSOD抗体由美国国立卫生研究院病理学试验室谢建武博士惠赠，辣根过氧化物酶（ HRP）标记的羊抗兔 IgG作为二抗购自 Sigma公司，其余生化试剂购自上海生物工程公司。
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肝癌组织及非癌肝组织中AFP mRNA的定量分析
一、资料与方法1. 样本收集：肝癌组织及非癌肝组织取自20例1998年3月～7月在东方肝胆外科医院经手术切除的新鲜原发性肝癌标本，经病理检查证实为肝细胞癌。男19例，女1例，年龄34～60岁，平均44.5岁，20例全伴肝硬化。肝癌分化程度按Edmondson法分级，正常肝组织来源于同期手术切除的5例肝海绵状血管瘤周围正常肝组织。男2例，女3例，年龄34～57岁，平均44.6岁。取肝癌组织、非癌肝组织及正常肝组织各200mg，标本必须自肿瘤离体后30min内置液氮速冻，再转-80℃冰箱冻存备检。2. AFP mRNA定量检测：取-80℃冻存肝癌组织、非癌肝组织及正常肝组织各100mg，加1mlTRIzol（Gibco BRL）试剂于DEPC处理匀浆器内电动匀浆，一步法抽提组织总RNA。PCR辅助转录滴定系统（Patty）法定量检测1μg总RNA中AFP mRNA含量，具体步骤参见文献[1]。3. 统计分析：两组间均数比较用t检验，非参数资料相关性大小用Spearman等级相关分析。二、结果1. AFP mRNA定量检测结果：肝癌组织AFP mRNA水平为106～1010拷贝/μg，平均为3.2×107±20.8拷贝/μg；非癌肝组织为104～107拷贝/μg，平均为6.3×105±5.9拷贝/μg；正常肝组织为104～105拷贝/μg，平均为6.8×104±2.8拷贝/μg。与非癌肝组织相比，60%（12/20）肝癌组织AFP mRNA高出102～106倍，20%（4/20)高出10倍，两组间差异有显著意义（Ｐ＜0.001）。在6例血清AFP阴性（＜30μg/L）肝癌患者中，66.7%（4/6）的肝癌组织AFP mRNA高于非癌肝组织。2. 肝癌组织AFP mRNA水平与肝癌各病理特征的关系：如表1所示，肝癌组织中AFP mRNA水平与肿瘤大小、分化程度及门静脉是否有癌栓无关（Ｐ＞0.20）。
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动脉吻合术后弹性纤维的扫描电镜观察
采用甲酸消化扫描电镜观察的方法了解吻合术后动脉弹性纤维变化. Wistar大鼠60只(第三军医大学实验动物中心提供),雌雄不拘,体重190±克/只 ,0.3%戊巴比妥钠腹腔麻醉,手术显微镜下,将大鼠一侧股动脉剪开并重新端端吻合, 实验动物随机分成6组(10只/组),模型6组和对照组(为各组未吻合侧动脉).于吻合后3 ,7,14,21,30,90天,切取吻合侧动脉和对侧股动脉,经10%中性甲醛溶液固定,将动脉段纵行中间切开,放于90%甲酸中,45℃消化96小时,液氮速冻,置真空蒸发器中干燥24小时,取出真空镀金后在扫描电镜下观察吻合口处结构.通过观察弹性纤维构筑发现,断端的弹性纤维并不能自行修复或粘连在一起,而是靠新生弹性纤维将吻合口两断端连接起来,而弹性纤维的增生部位常在原内弹性膜的管腔侧,即在内膜增生的部位, 血管损伤后吻合口弹性纤维的重建主要依靠新生内膜处的弹性纤维增生联接.股动脉吻合术后弹性纤维的构筑形态与正常组相比较,在股动脉吻合术后3～7d吻合口中心弹性纤维缺失;在股动脉吻合术后14d可见弹性纤维细丝跨越吻合口,这些纤细的弹性纤维互相联结 ;股动脉吻合术后21d可见弹性纤维致密,弹性纤维互相联结增多,在部分吻合口由于在吻合时血管外翻,在原内膜面上可见新生弹性纤维形成网状层,呈穹隆状;股动脉吻合术后 30d,新生弹性纤维融合成片,内膜弹性组织形成内弹性膜状,上面有大小不等的网孔, 中膜弹性纤维和外膜弹性纤维均呈纤维条索状,弹性组织整体结构趋于正常对照组弹性纤维构筑.本文将弹性纤维的重构分为:静止期、增生期、重建期.
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改良液氮速冻法转化大肠杆菌细胞
感受态大肠杆菌细胞的制作和转化是分子生物学领域基因工程中常用和基本的技术.目前主要采用电转化法,Hanahan改良法和Cohen改良法[1].电转化法效率高,但需要特殊的基因导入仪器,而Hanahan法和Cohen法操作比较繁琐.笔者在实践中摸索出适应快速分子克隆需求,简便实用的改良液氮速冻转化大肠杆菌细胞的方法,可供广大基因工程人员参考.
