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血浆miRNA-486-5p作为口腔鳞癌复发标志物的临床研究
目的:筛选并验证血浆miRNA-486-5p作为口腔鳞癌复发标志物的潜力.方法:按照纳入、排除标准选择28名口腔鳞癌患者和21名健康对照者.实验组分别于术前1周内以及术后1年采集血浆两次,健康对照组采集血浆一次.将其中8例鳞癌样本和3例对照组样本构建cDNA文库后进行高通量测序,筛选目标miRNA,利用其余血浆样本对目标miRNA进行验证.结果:鳞癌患者血浆中表达量高的miRNAs为miRNA-486-5p,占miRNAs总表达量的39.6％,且存在差异性表达.术后无复发组及正常对照组血浆miRNA-486-5p均较术前组表达升高(P＜0.01,P＜0.05),而术后复发组与术前组无显著差异(P＞0.05).结论:血浆miRNA-486-5p的表达水平与口腔鳞癌的复发相关,有潜力作为监测肿瘤术后复发的候选标志物.
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下一代测序数据的质量控制研究
目的：对下一代测序数据质量控制的几个主要问题进行分析，设计数据清理和质量控制软件，为下游的数据分析提供保障。方法基于Bioconducter 软件包，开发了一个数据清理软件（ Fastq_clean ）。结果该软件在一组已发表的菊花转录组数据集上测试，得到了清理后的测序数据，同时输出了质量控制信息。结论该软件在充分利用Illumina序列特征的基础上，可以非常精确地去除低质量残基、接头、rRNA和病毒等污染，大限度保留了高质量数据。
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急性和慢性髓性白血病细胞中可变剪接事件的识别
目的：为揭示异常的可变剪接在肿瘤中发挥的作用，着重研究急性髓性白血病（ AML）与慢性髓性白血病（CML）内显著差异的可变剪接事件以及剪接异构体。方法基于CML（K562）和AML（THP1、HL－60）细胞系的全转录组测序数据，在全基因组范围内采用TopHat、MATS和Cufflinks计算识别可变剪接事件、重构剪接异构体和分析其差异表达。结果在AML和CML细胞间识别的130个基因在CML细胞系中特异性高表达，80个基因在AML两株细胞系内均表达上调。在CML与AML之间识别了337个差异表达的剪接异构体以及35个差异可变剪接事件。结论 AML与CML细胞系间存在显著差异的可变剪接事件和剪接异构体。白血病相关的可变剪接事件可作为其潜在的标志物或药物靶标。
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应用高通量测序技术分析小单链RNA分子在血清中的稳定性
目的 通过小单链RNA高通量测序方法分析小单链RNA分子在血清中的稳定性,为获得研发小RNA药物的序列特点提供基础.方法 人工合成21nt随机序列小单链RNA分子库,用血清孵育后回收小单链RNA分子,进行高通量RNA测序,对测序结果进行比较分析.结果与结论 人工合成的不同序列小单链RNA分子在血清中存在稳定性差异,稳定性小单链RNA分子呈现出碱基偏性和基序特征. 上述结果将为小RNA分子药物设计和筛选提供参考.
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基于高通量测序数据的微生物检测算法研究进展
新一代高通量测序技术的发展，推动了多个相关研究领域的发展。国际上许多研究机构正在研究利用高通量测序数据进行微生物检测的算法，目前已有一些基于高通量测序数据的微生物检测算法流程设计成功并公开发布。该文通过调研利用高通量测序数据进行微生物检测的相关文献，研究已发布的基于高通量测序数据的微生物检测算法的功能和实现流程，分析几个有代表性算法的优点和不足。后，对这些检测算法的设计思路进行总结和分类，提出基于高通量测序数据的微生物检测算法的改进设想。
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基于高通量测序数据的快速病毒物种分析工具
目的 基于高通量测序技术,开发一款轻量级的、使用方便的快速病毒鉴定工具.方法 构建本地化的病毒核酸序列数据库,对大型公共数据库中的病毒核酸序列,按同源性进行去冗余等处理.基于该数据库,实现自动化的数据库比对、de novo拼接和再比对的生物信息学流程,解读数据中病毒的信息.采用Django框架,对数据库、流程和结果进行封装,使用中文操作界面,并采取一键出结果的方式,用图表的形式在浏览器端展示病毒分析结果.结果 该工具可安装运行于普通个人计算机.利用5例腺病毒非培养样本高通量测序数据(1.78 Gbp)和5例埃博拉病毒非培养样本数据(0.93 Gbp)进行测试,分别在2.9和67.9 min完成整个分析流程,并返回正确、易读的病毒物种的分析结果.结论 该工具部署方便、操作简单,可快速实现病毒物种水平的鉴定,适用于生物安全事件的快速响应,为病毒病原体进一步确证和研究提供依据和参考.
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高通量测序在海洋生物活性物质开发中的应用前景
新一代测序仪以高通量、速度快、低成本为主要特征,在海洋生物活性物质基因资源挖掘中已显示出巨大潜力.高通量测序技术已成为高效、大规模和全面开发海洋生物资源的基础和重要手段.本文概述了新一代测序技术的基本原理、目前的应用现状及其优势,分析了海洋生物活性物质的研究现状和基于新一代高通量测序技术在海洋生物“组学”研究、海洋生物活性物质基因挖掘中的应用情况和应用前景.
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运用基于高通量测序和大数据挖掘的元基因组学方法分析中药制剂的物种成分
中药制剂质量评价以化学成分分析为主,而物种成分分析近年来引起了中医药界的极大关注,特别是对于丸剂类中药制剂的质量评价更为重要.建立中药制剂物种成分的快速、准确、系统的分析方法,是实现中药现代化、产业化和国际化的关键之一.中药制剂物种成分分析的实质是对包含多个生物物种的混合体系(混合生物样本)的物种鉴定.基于高通量测序和大数据挖掘技术的元基因组学方法是目前认识、分析生物混合体系结构和功能有效、重要的方法之一.利用元基因组学方法将有助于建立中药制剂的物种评价方法.通过选择合适的DNA分子标记,可对配伍处方药材物种进行鉴别,同时通过大规模数据分析和挖掘鉴别制剂中的混伪品、有毒动植物或受保护动植物的成分,以及在生产过程引入的生物杂质,从而为中药制剂的有效性、安全性和合法性提供评价依据.
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高通量测序技术研究黄芩汤对溃疡性结肠炎大鼠肠道菌群的影响
研究黄芩汤(HQT)对溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)大鼠肠道菌群的影响,探讨黄芩汤改善溃疡性结肠炎与肠道菌群的关系.选取15只雄性Wistar大鼠随机平均分为对照组(control group)、模型组[三硝基苯磺酸(TNBS) group]和黄芩汤给药组(TNBS+HQT group),以复合法(TNBS+乙醇)制备细胞免疫反应UC大鼠模型.给药10天后,采集15只大鼠粪便样本,提取粪便样本总DNA,根据细菌16S rRNA V3～V4区设计引物进行扩增,利用Illumina Miseq平台进行高通量测序.研究发现:主成分分析(PCA)、主坐标分析(PCoA)和基于β多样性距离的非度量多维尺度分析(NMDS)结果显示3组大鼠肠道菌群组成存在明显差异;与对照组相比,模型组乳酸杆菌属显著减少(P＜0.05),毛螺菌属、脱硫弧菌属、罗氏菌属和瘤胃菌属显著增多(P＜0.05);与模型组比较,黄芩汤给药组乳酸杆菌属显著增多(P＜0.01)、理研菌属显著减少(P＜0.05).本研究表明黄芩汤可能是部分通过调节肠道菌群的结构而发挥治疗溃疡性结肠炎的作用.
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纳米山药多糖合生元结肠靶向微生态调节剂对大鼠肠道菌群的影响
目的:研究纳米山药多糖合生元结肠靶向微生态调节剂对大鼠肠道菌群的影响.方法:以盐酸林可霉素灌胃给药造成肠道菌群失调模型,将大鼠随机分成正常对照组、靶向制剂组、阳性对照组、自然恢复组和模型组.给药10d后,取各组大鼠结肠粪便,并对大鼠粪便菌群16S rRNA的V3-V4区进行扩增,Miseq高通量测序平台测定其基因序列,与silva数据库中微生物基因序列进行比对和分类,测定各组模型大鼠肠道菌群的变化.结果:各组大鼠肠道菌群在门的水平上,靶向制剂组、阳性对照组和正常组的主要优势菌门为厚壁菌门.与模型组相比,靶向制剂组、阳性对照组的数量具有显著性差异(P＜0.05);各组大鼠肠道菌群在纲的水平上,与自然恢复组相比,靶向制剂组和阳性对照组的梭菌纲相对含量与自然恢复中存在显著性差异(P＜0.05),并且靶向制剂组的芽孢杆菌纲和产芽孢菌纲数量明显增多.结论:纳米山药多糖合生元结肠靶向微生态调节剂能调节肠道菌群,具有增加肠道优势菌数量的能力.
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不同软件平台分析肠易激综合征患者肠道菌群结构的比较
目的:探讨不同软件平台对肠易激综合征(irritable bowel syndrome,IBS)患者肠道菌群结构的分析结果是否存在差异,以及分析结果对疾病鉴别和疗效评价能力的影响.方法:应用Uparse及Mothur软件平台分别对27例粪便菌群16S rRNA高通量测序结果进行分析,比较两种软件平台所得的肠道菌群结构.27例样本中包含健康对照(healthy control,HC组)9例,腹泻型IBS患者治疗前(IBS组)及治疗后(IBS-treatment,IBSt组)各9例.比较两种软件平台所得的肠道菌群结构在HC组vs.IBS组和IBS组vs.IBSt组间的差异.结果:(1)Uparse及Mothur平台分析所得的27例粪便样本菌群结构在门水平差异不显著,而科水平和属水平差异显著;(2)不论是Mothur平台还是Uparse平台,HC组vs.IBS组、IBS组vs.IBSt组,菌群结构差异无统计学意义(Uparse平台:HC组vs.IBS组,F=0.98,P=0.445;IBS组vs.IBSt组,F=0.47,P=0.926;Mothur平台:HC组vs.IBS组,F=0.82,P=0.646;IBS组vs.IBSt组,F=0.37,P=0.961);IBSt组肠道菌群Shannon指数显著低于IBS组;(3)通过差异物种分析,两个平台数据都能得出HC组与IBS组的差异菌属,而仅Uparse平台的数据能够得到IBS组和IBSt组的差异菌属.结论:不同平台对于相同菌群高通量测序分析的结果存在分类学及丰度上的差异,为了提高研究的可重复性和可靠性,尤其是在比较不同研究所得的肠道菌群结构的共性时,特别需要注意数据分析方法的应用与选择.
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Usher综合征患者致病突变基因的研究
目的 研究1例Usher综合征患者的致病突变基因.方法 选取解放军总医院院2015年4月眼科门诊1例临床诊断Usher综合征的39岁女性患者及其家系内所有成员(包括患者及非患者)为研究对象,提取其外周静脉血DNA,建立基因组DNA标本库,针对目前已知的Usher综合征致病基因,对患者基因组DNA进行目标区域捕获高通量测序,锁定该患者致病基因,并进一步对该家系中的其他成员(包括患者及非患者)进行相关突变位点的验证,终确定该患者的致病基因突变.结果 该患者致病突变定位于10q22.1的CDH23基因,由c.6253+1G＞A和c.287_288insG两个位点组成的复合杂合突变致病.在患者家系中,与患者有血缘关系的成员均具有符合Usher综合征这一单基因遗传病规律的基因型,而与患者无血缘关系的家庭成员均无上述两处基因位点的突变.结论 运用目标区域捕获高通量测序技术,可以在Usher综合征患者中实现致病基因的突变筛查,结合其他家庭成员的基因位点验证,可明确Usher综合征患者的具体致病基因突变.
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在人类胰腺癌细胞BxPC3全基因组中受Notch-1胞内结构域和CBF-1转录共调控的靶基因特征分析
目的在人类胰腺癌细胞BxPC3全基因组水平上寻找受Notch-1胞内结构域和CBF-1共同转录调控的靶基因；分析它们的类型、功能和在基因组中的分布等特征值；并以此为基础预测Notch信号通路的潜在生物学功能和调控模式。方法染色质免疫共沉淀联合基于Illumina/Solexa平台的高通量测序。结果1)Notch-1胞内结构域和CBF-1两组样本有效read数分别为14287722和14289280个,与人类参考基因组唯一匹配的read数分别为11782027和11711920个；2)两组样本的peak数分别为385和492个,peak区域分别为318344 bp和383768 bp,都占全基因组的约0.01%；3)两组样本的peak区域几乎集中于基因间区和内含子区,只有不到5%位于外显子区；4)两组样本的peak对应基因数分别为150和287个,其中共有基因93个；5)通过基因聚类分析和数据库比对可以查到这些基因的名称、分类、基本功能和在基因组中的位置等具体信息。结论在人类胰腺癌细胞BxPC3全基因组范围内找到了更多在转录水平上受CBF-1和Notch-1胞内结构域共同调控的未知靶基因；初步明确了它们的类型、分布和功能等特征值；这些数据可以为进一步分析Notch信号通路潜在的生物学功能和调控模式奠定基础。
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利用RNA捕获法在全基因组进行egfr启动子片段的富集
目的 以表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,egfr)启动子片段为目标靶序列,用RNA捕获法在全基因组进行靶序列的富集,结合第二代测序技术,实现候选基因区段的深度测序.方法 本研究以宫颈癌细胞系HeLa S3 egfr启动子为模型,提取基因组后用Mbo Ⅰ酶切,补平加PE接头,回收400 bp～1 000 bp 的DNA 片段作为模板,并用egfr启动子RNA与制备的基因组模板杂交将egfr启动子片段富集,富集的DNA片段PCR扩增15轮后用Solexa高通量测序.结果 通过生物信息学技术分析,从实验组中随机取总条数为106 reads,比对到egfr启动子片段reads条数为1 889条,而比对到随机挑选的notch 1、pdgf-B、src基因reads条数分别为2、3、3条.从人类全基因组随机取总条数为106的等长reads作为对照组,比对到notch 1、pdgf-B、src、egfr基因reads条数分别为3,2,3,2条.在本实验中egfr启动子片段通过RNA捕获法被富集了630倍.结论 用本研究建立的RNA捕获法进行基因组靶序列捕获、富集、测序文库建立的技术路线可行,所建DNA文库可直接用于Solexa测序仪的测序.RNA捕获技术与第二代高通量测序技术结合能应用于靶区域的重测序,研究可变剪切、核小体分布,发现和分析新的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)位点,寻找许多复杂疾病相关基因及位点,针对性强,简便易行,节约成本.
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母血中胎儿游离DNA进行地中海贫血的无创产前诊断研究
目的 探讨母血中胎儿游离DNA进行地中海贫血的无创产前诊断价值.方法 选取我院2014年6月～2016年1月的10例地中海贫血妊娠妇女为研究对象,与传统的羊水穿刺诊断进行比较,采用孕妇外周血血中胎儿游离DNA高通量测序诊断,分析高通量测序方法的检出率、误诊率、漏诊率.结果 胎儿游离DNA高通量测序的检出率、误诊率及漏诊率分别为90.0％(9/10)、0.0％(0/10)和10.0％(1/10),与金标准比较基本一致,可以用于地中海贫血的诊断.结论 胎儿游离DNA高通量测序可以用于地中海贫血的无创产前诊断,对临床有一定的指导及应用意义.
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宁波地区人群肠道菌群的特点及对结直肠癌与癌前病变发生和发展的影响
目的 探讨肠道细菌在健康人类、大肠肿瘤患者和大肠息肉患者之间的差异,分析微生物对大肠息肉及大肠肿瘤的发生、进展的影响.方法 样本来源于常规做肠镜检查患者的粪便以及术前愿意参加实验的患者,分为3大组:肠镜检查健康组、息肉组和大肠腺癌组,同时以高血压为独立的考察因素,健康组和息肉组又各分为高血压和非高血压2个亚组,样本经过DNA提取后,16SrRNA基因全长扩增和V3、V4区PCR扩增,采用DGGE预评判提取DNA质量,采用高通量测序技术分析各样本中细菌的种类和丰度,并通过主成分分析探讨不同分组患者肠道细菌的多样性和群落结构差异.结果 不同分组患者的肠道细菌具有较高的多样性,在获得的所有OTUs中,厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门、梭杆菌门分别占44.9％、28.4％、18.6％和5.5％,这4门的OTUs累计占97.4％.这些构成了大多数样本中的优势菌,但不同样本中优势细菌的组成有显著的区别.各分组的多样性指数统计分析发现,不同组之间的多样性指数差异不显著.健康人肠道细菌群落结构与肿瘤患者有着显著差异,结肠息肉患者的肠道细菌群落结构与健康人群的肠道细菌群落结构差异显著.健康组中非高血压和高血压组的肠道细菌群落结构差异无统计学意义,结肠息肉组中非高血压和高血压组的肠道细菌群落结构差异无统计学意义.结论 肠道菌群的变化可能影响或导致结肠息肉和结肠肿瘤的发生、发展,观察肠道菌群的变化有助于研究结肠癌发展的微环境及机制,而高血压对健康人和肠道息肉患者的肠道菌群变化的无显著影响.
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高通量测序技术在胚胎植入前诊断中的应用
随着辅助生殖技术的迅速发展,胚胎植入前诊断的方法也更加快速、准确.随着全基因组扩增技术的完善、胚胎玻璃化冷冻技术的成熟,高通量测序技术开始应用于胚胎植入前诊断,并凭借着通量大、速度快、准确度高、价格经济等优势得到越来越多的关注和研究.现在不仅能对胚胎的全基因组染色体异常进行筛查,还能对单基因病进行诊断,选择植入健康的胚胎.胚胎活检技术和高通量测序技术正在不断的发展和进步,未来可能在不损伤胚胎的情况下就能对胚胎的遗传情况进行准确的检测.
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基于高通量测序技术分析肠道菌群与肥胖的研究进展
肥胖是脂肪组织堆积引起的一种多基因调控的代谢性疾病.近年来,胃肠道-内分泌代谢间的相互作用关系备受关注,肠道菌群作为一个新的影响因素在肥胖的发生、发展中发挥重要作用.随着人类宏基因组计划的启动及高通量测序技术的发展,基于高通量测序技术为平台,将肠道菌群为靶点的精准体质量管理策略成为研究热点.目前肠道菌群干预减重的方法主要包括饮食干预、微生物制剂的使用、减重手术和粪菌移植等,然而肠道菌群的调节对减重效果的影响因方法的不同而异.
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环状RNA在疾病发生中的作用
环状RNA (circRNA)是一类不同于线性RNA的内源非编码RNA,它是通过反向剪接形成的闭合环状RNA分子,不具有5'端帽子和3'端polyA尾巴结构,能够稳定存在于各种类型真核细胞中.随着生物信息学的快速发展和高通量测序技术的不断革新,目前已经在真核细胞中发现了大量内源性circRNA,其中一些circRNA表达丰度高并呈现出时空表达特异性和物种间保守性,表明circRNA可能在调节基因表达方面具有重要功能.近年来研究发现,circRNA在神经系统紊乱、糖尿病和肿瘤等疾病发生过程中起着较为重要的作用,深入研究circ RNA的结构和功能可更好地了解疾病的发生机制,提高相关疾病的预防和诊断水平.
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不同龋敏感儿童牙菌斑微生物多样性分析
目的：利用高通量测序方法，研究 ECC 儿童和 S-ECC 儿童牙菌斑微生物的多样性变化，探索儿童龋病的病因学。方法采集 ECC儿童和 S-ECC 儿童牙菌斑样本，利用 Il umina MiSeq 测序方法，针对16SrRNA 基因 V4变异区设计通用引物进行测序分析菌群微生物的群落变化。结果测序总共测得1669057条有效序列，平均有效率为89.16%，共1514个操作分类单位（OTU）。结论儿童龋病的发生发展与链球菌属等菌属密切相关，其种群的多样性呈现特异性的富集。
