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青海汉族和藏族高龋患者口腔微生物多样性差异研究
目的:采用高通量测序研究青海汉、藏族高龋患者口腔疾病微生物的多样性和群落差异.方法:选择我院口腔内科门诊汉、藏高龋患者各10例唾液样本,利用Illumina MiSeq平台进行细菌16S rRNA基因(V3-V4)区高通量测序,并利用Mothur软件分析微生物的群落结构和多样性.结果:基于97%的相似性类聚获得汉、藏高龋患者口腔微生物物种注释(Operational taxonomic unit,OTU)数目分别为51和30.汉族组分类学地位明确的有4门7纲28属,藏族组有2门4纲22属.汉族高龋组有12种优势种群,依次是:假单胞菌属(32.52%)、肠杆菌目未分类菌属(29.91%)、明串珠菌属(10.56%)、肠膜菌属(4.71%)、乳球菌属(3.71%)和链球菌属(3.04%)等.藏族组的优势菌主要有4个,依次是TM7-3未知菌属(55.86%)、未知菌属SR1(20.36%)、黄色单胞菌目未分类菌属(17.38%)和假绿黄单胞菌(2.46%).结论:青海汉族龋患者群的唾液微生物多样性与丰度明显高于藏族组,且优势微生物种群亦存在明显差异.
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胃癌患者肿瘤组织与外周血T细胞受体CDR3的差异分析
目的:采用高通量测序技术研究胃癌患者肿瘤组织、癌旁组织及血液中T细胞表面抗原受体(TCR)的构成及克隆表达等特性.方法:收集7例胃癌病例的肿瘤组织、癌旁组织、外周血标本,提取DNA,经多重PCR,对TCRβ链CDR3区进行建库,采用Illumina HiSeq 2000测序系统测序,经过数据处理和比对分析,比较胃癌组织TCR CDR3组库的组成特征.结果:通过比较胃癌的三组标本的TCRβ链CDR3区克隆表达情况,获得了23种差异取用的VJ基因组合及41种差异取用的氨基酸序列,但三组样品间TCR CDR3克隆型的分布无显著差异.结论:胃癌患者癌旁组织、肿瘤组织及外周血存在差异取用的VJ基因组合及氨基酸序列.尽管不同组织中CDR3克隆型的分布并无显著差异,癌旁组织可能受到肿瘤组织及循环血液的共同影响,克隆型多数为低表达,多样性更高.进一步研究癌旁组织的TCR克隆型特征对于明确胃癌肿瘤微环境的特性及肿瘤特异性抗原的鉴定可能具有重要意义.
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SELEX技术进展
经过几十年的发展,核酸适配体已经从基础研究迸入到开发应用阶段.核酸适配体以其特异性高和稳定性强被广泛认可.近年来,随着核酸适配体体外筛选技术(SELEX)的逐步改善,在核酸适配体的优化、分离、扩增以及筛选方面取得了一些成果,极大地促迸了核酸适配体的开发速度.本文对高通量新一代测序技术、生物信息学和SELEX技术相结合的研究迸展迸行综述.
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基于Illumina测序分析青海土族牙周病患者可疑致病微生物的组成差异和种群结构
目的 初步探究青海土族人群中牙周病可疑致病微生物的组成差异和种群结构.方法 选择青海省土族居民牙周病样本10例,利用Illumina MiSeq平台进行细菌16S rRNA基因(V3-V4区)高通量测序,并利用Mothur软件分析微生物的群落结构和多样性.结果 基于97％的相似性类聚,获得牙周病组物种注释OTU(Operational taxonomic unit)数目为156个,分类地位明确的细菌属有48个.土族牙周病患者中检出的已知致病微生物种属主要包括消化链球茵属Peptostreptococcus、微单胞茵属Parvimonas、卟啉单胞茵属Porphyromonas、普雷沃茵属Prevotella、拟杆菌属Bacteroides、密螺旋体属Treponema和小类杆菌属Dialister,以及可疑的致病微生物属肠杆菌科未知属Enterobacteriaceae unclassified、希瓦氏茵属Shewanella、克雷伯氏茵Klebsiella、奈瑟氏茵属Neisseria、嗜血杆菌属Haemophilus、乳球菌属Lactococcus、明串珠菌属Leuconostoc、韦荣球菌属Veillonella、普罗维登斯茵属Providencia等.结论 青海土族人群中牙周病可疑致病微生物的组成差异较大、种群结构复杂.
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乳腺癌患者肠道菌群高通量测序初步探索
目的 比较乳腺癌患者与健康妇女肠道菌群分布,分析乳腺癌患者肠道菌群结构及其多样性特征,初步探讨乳腺癌患者肠道菌群的变化与乳腺癌的关系.方法 根据纳入标准选取20例乳腺癌为病例组,25例健康妇女作为健康对照组.通过Illumina Miseq平台对样本粪便DNA中所有细菌进行16sDNA V3~V6区高通量测序,测序结果进行可操作分类单元(OTU)聚类分析、多样性及结构分析得出2组人群肠道菌群结构、丰度及多样性.结果 病例组和健康对照组妇女肠道菌群经高通量测序得到的优化序列分别是949 927条和781 683条,α-多样性指数进行比较分析,2组肠道微生物菌群多样性指数差异无统计学意义;病例组在门水平上比较,拟杆菌门(Bcatroidetes)显著低于健康对照组 (P <0.01),而厚壁菌门(Firmicutes)明显高于对照组 (P <0.05).2组在属水平上进行菌群结构比较,2组中差异有统计学意义的菌属有拟杆菌属(Bcatroidetes)、普氏菌属(Prevotella)、Faecalibacterium等18个菌属 (P <0.05).结论 相比健康妇女,乳腺癌患者的肠道菌群含量和丰度明显下降,乳腺癌可能跟肠道微生态的恶化有关联,其中乳腺癌患者的拟杆菌更是显著下降,说明拟杆菌可能跟乳腺癌的发生、发展有关.
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实时荧光定量PCR联合高通量测序分析杠柳毒苷与三七总皂苷配伍对大鼠肠道菌群的影响
目的 采用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)法和Illumina高通量测序技术研究杠柳毒苷和不同比例三七总皂苷配伍对大鼠肠道菌群的影响.方法 将15只SD大鼠随机分为杠柳毒苷单独给药组(A组)、杠柳毒苷和低剂量三七总皂苷配伍组(B组)、杠柳毒苷和高剂量三七总皂昔配伍组(C组),每组5只.按杠柳毒苷10 mg/kg、三七总皂苷0.74和2.22 g/kg(分别相当于香加皮与三七的配伍比例为1:1和1:3)的剂量ig给药,连续给药7d.给药结束后收集大鼠粪便,进行qRT-PCR反应和高通量测序.结果 qRT-PCR结果表明,与杠柳毒苷单独给药组比较,杠柳毒苷和三七总皂苷配伍后,总菌、拟杆菌的相对含量显著升高(P＜0.05、0.01),而乳酸杆菌的相对含量呈现降低的趋势;Illumina高通量测序结果显示,在微生物群落结构上,杠柳毒苷配伍三七总皂苷后,拟杆菌的相对丰度明显升高而乳酸杆菌的相对丰度呈现降低的趋势;在肠道菌群多样性上,3组样品的多样性指数间无显著性差异.结论 杠柳毒苷和不同比例的三七总皂苷配伍后,可对大鼠肠道中的总菌、乳酸杆菌及拟杆菌产生一定影响,但对肠道菌群多样性的影响不明显.
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高通量测序分析附子、红参不同比例配伍对大鼠肠道菌群的影响
目的 初步研究附子、红参不同比例配伍对大鼠肠道菌群的影响.方法 红参、附子分别采用8倍体积的70％乙醇加热回流提取2次,每次1h,制备醇提物.将15只SD大鼠随机分成A、B、C3组,每组5只,A组为附子醇提物单独给药组,给药量为0.415 g/kg,B、C组分别为附子、红参配伍比例1∶1(红参醇提物1.17 g/kg)和1∶2(红参醇提物2.34 g/kg)给药组,每天ig给药1次,连续给药7d.给药结束后,于第8天收集大鼠粪便,提取粪便中细菌的DNA,对粪便菌群的16Sr-RNA的V4区进行扩增,利用Miseq高通量测序平台进行基因序列的测定,利用Uparse software对序列进行分析,将相似性在97％以上的序列进行归并,生成分类操作单元(OTU);利用QIIME软件计算样品的菌群丰度指数(Ace、Chao1)、菌群多样性指数(Simpson、Shannon).结果 A组和B组的OTU数量较C组显著增多(P＜0.05);A组和B组Ace、Chao1指数为1 393、1 368和1 085、1 057,C组Ace和Chao1指数为889和884,A组和B组较C组显著增多(P＜0.05、0.01);厚壁菌门、拟杆菌们和变形菌门均为3组样品中的优势菌门;在属的水平上,C组中乳酸杆菌属和拟杆菌属含量较A组和B组增加.结论 红参与附子不同比例配伍可对大鼠肠道菌群产生显著的影响,随红参比例的增加,可能在一定程度上改善肠道的微生态环境.
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高通量测序和实时荧光定量PCR分析何首乌肝损伤与肠道微生物组的关系
目的 采用Illumina高通量测序技术和实时荧光定量PCR (Real-Time PCR,RT-PCR)法研究何首乌(PM)致肝损伤与肠道微生物组间的关系,并验证两种定量方法的一致性.方法 雄性SD大鼠随机分为5组:对照组、脂多糖(LPS)组、LPS+对乙酰氨基酚(APAP)组、PM组和LPS+PM组;大鼠尾iv给予4.0 mg/kg LPS建立肝损伤模型,各组相应每天1次ig给予0.625 g/kg APAP和12g生药/kg PM,记录大鼠体质量;分别于造模后2、14h、5和8d,对大鼠粪便中细菌16SrRNA基因的V4高变区进行Illumina高通量测序,根据测序结果得出的差异物种,采用RT-PCR进行验证;取造模后8d大鼠肝脏组织,HE染色,光学显微镜观察.结果 大鼠肝脏病理学检查结果显示,与对照组比较,LPS组大鼠存在肉芽肿,PM组无异常病变;与LPS组比较,LPS+PM大鼠肝细胞出现轻度变性和微小肉芽肿增多,LPS+APAP组可见微小肉芽肿和淋巴细胞浸润.Illumina高通量测序结果提示,与对照组比较,随着PM给药次数增加,单独给予PM的大鼠肠道微生物无显著变化;LPS+PM组表现为肠球菌科和毛螺旋菌科细菌逐渐增加,乳杆菌属细菌减少,且与LPS组有差异;RT-PCR结果显示,与对照组比较,随着PM给药次数的增加,单独给予PM的大鼠肠道微生物无显著变化;LPS+PM组肠球菌科、毛螺旋菌科细菌数显著增加(P＜0.05),乳杆菌属细菌数显著减少(P＜0.05),且与LPS组比较有显著差异.结论 PM肝损伤大鼠存在不同程度的菌群失衡,且Illumina高通量测序和RT-PCR检测结果具有良好的一致性,但Illumina高通量测序技术可获得更多的微生物信息,更具优势.
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多种测序技术在药品检测环境微生物鉴定分析中的应用研究
目的:探索多种测序技术在药品检测环境微生物鉴定分析中的应用.方法:从药品微生物实验室环境中连续7个月采样收集获得248株细菌和6株霉菌,并对收集的细菌采用全自动微生物生化鉴定仪(Vitek 2 Compact)进行鉴定.根据生化鉴定结果选择在种属分类学上具有代表性的20种细菌(共28株)和6株霉菌分别采用一代测序技术(ABI 3500测序平台)和宏基因组测序技术(Hiseq 2000测序平台和Ion torrent测序平台)进行鉴定分析,相互验证菌株鉴定方法的准确性.结果:28株细菌的16S rDNA一代测序鉴定与生化鉴定相比,属水平分类一致的有23株,种水平分类一致的有10株.采用Hiseq 2000对28株细菌混合进行全基因组测序鉴定获得78种菌株信息,与16S rDNA一代测序相比,种水平一致的有15株,属水平一致的有2株,缺失了3株菌的信息,多出了61株菌的信息;霉菌全基因组测序获得3株菌信息,与霉菌LSU rDNA的一代测序结果相比,缺失了3株菌的信息.采用Ion torrent对28株菌混合进行16SrDNA宏基因组测序鉴定,获得信息包含7科、10属和13种,与16S rDNA一代测序结果对应的有11种,且10种属覆盖了一代测序中的28株菌;霉菌ITS2宏基因组测序结果包含4属和3种,4属覆盖了霉菌一代测序结果中的6株菌,但种水平只有烟曲霉和一代测序结果一致.结论:新一代宏基因组测序技术及分析方法需要进一步改进与完善,才能对环境微生物混合菌株进行快速准确鉴定从而开展建库溯源工作.
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早发性卵巢功能不全的遗传学新研究进展
早发性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency,POI)是指女性40岁以下发生绝经至少4个月,且卵泡刺激素(FSH)数值在＞4周的两次检测中均高于25 IU/L.该病在40岁以下女性中发病率约为1％,是导致女性不孕的重要因素之一.近年来随着我国女性婚育年龄的提高,POI引起的不孕问题更加突出.遗传学致病因素是POI发病的原因之一,近年来高通量测序技术及精准医学的发展使研究者更加准确并快速的定位并确定POI致病基因及突变.本文将综述近期POI遗传学领域新的重要研究进展,并对相关进展进行评述.这些研究进展对育龄女性的遗传咨询、生育风险评估和遗传诊断等方面将发挥重大作用.
关键词： 早发性卵巢功能不全(POI) 卵巢早衰(POF) 遗传 基因突变 高通量测序 -
高通量测序技术在动物MicroRNA研究中的应用
简述了动物MicroRNA的发生、作用机制和近几年高通量测序技术在动物MicroRNA研究中的应用进展。
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基于高通量测序进行无创产前亲子鉴定的可行性
目的 初步探讨基于高通量测序进行STR分型的技术方法应用于无创产前亲子鉴定的可行性.方法 选择13个STR基因座(6个常染色体STR基因座,6个Y染色体STR基因座,1个性别判定基因座),进行复合PCR扩增和高通量测序文库构建后,采用Ion PGM400高通量测序平台进行测序,并采用自主研发软件NGS-STRgenotyper (perl脚本)进行STR分型,本文简称上述过程为NGS-STR分型.对13个母子配对混合样本(母亲:儿子=2％～50％)、1组家系样本进行了上述NGS-STR分型,旨在(1)了解其在混合样本中的灵敏度及分型情况;(2)了解其在无创产前亲子鉴定中的应用可能性.结果 (1)当混合样本中低组分(儿子)的比例超过8％,所有基因座均可检出低组分的STR信息;(2)对1例血浆样本进行NGS-STR分型,共计69.2％的基因座可检出胎儿的STR基因型信息,且所有检出基因座均符合孟德尔遗传规律.结论 初步证明了NGS-STR分型技术具有进行无创产前亲子鉴定的可行性.
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1对同卵双生新生儿DNA甲基化谱差异分析
目的 探索1对同卵双生新生儿之间DNA甲基化谱的差异.方法 应用甲基化免疫共沉淀结合高通量测序法对1对同卵双生新生儿的DNA甲基化谱进行检测,分析基因组DNA甲基化特点及其之间的差异,筛选适用于法医学分析的甲基化位点.结果 两样本各获得7300万原始测序序列(raw reads)数据,与人类基因组参考序列比对,各得到4800万和5000万唯一比对reads,其中大部分分布在重复区域,且在Alu序列分布为广泛.两样本DNA甲基化富集区域(peak)各检测到257 362条和197 272条,基因组覆盖率分别为6.53％和5.29％,分布在基因组不同区域,以中间内含子区含量多.分析两样本甲基化差异区域得到2205条差异的甲基化序列,其中595条位于基因区域,1610条位于基因间区,从中筛选出113条序列,用于进一步深入研究其法医学应用价值.结论 本研究初步证实了DNA甲基化用于同卵双生子鉴定的可行性,为筛选同卵双生子DNA甲基化差异位点提供了基础数据.
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阪崎肠杆菌培养上清蛋白引起HepG2肝细胞的基因表达变化
目的:通过高通量测序法分析阪崎肠杆菌培养上清蛋白引起HepG2肝细胞的基因表达变化,并探讨阪崎肠杆菌致病作用的分子机制.方法:采用CAYE培养基培养阪崎肠杆菌,硫酸铵沉淀法及膜透析法分离纯化上清蛋白;分别在1×106/mL的HepG2肝细胞培养液中加入终浓度为1.6 μg/mL的上清蛋白稀释液及蒸馏水作为实验组和对照组,提取细菌总RNA;构建文库并运用illumina测序平台测序,分析两组间的基因表达差异,采用Gene Ontology(GO)富集分析和Pathway分析了解差异表达基因的功能;荧光定量PCR(qPCR)验证RPS18、RFC4基因差异表达结果.结果:高通量测序结果显示,与对照组相比,实验组HepG2细胞存在5 120个差异表达基因,其中上调2 155个,下调2 965个;GO富集分析显示差异基因主要参与细胞核分裂、有丝分裂、复制等多个生物学过程,Pathway分析显示差异基因主要与DNA复制、蛋白转运、精氨酸和脯氨酸代谢等有关;qPCR验证结果与高通量测序结果一致.结论:阪崎肠杆菌培养上清蛋白能够引起HepG2肝细胞RPS18、RFC4等基因的表达变化,并可能与核糖体变化和/或DNA复制与修复有关.
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高通量测序在尸体微生物及死亡时间推断中的应用
腐生生物是引起尸体组织腐解的主要因素,研究腐败过程中微生物的演替规律是法医微生物学(forensic microbiology)的主要任务之一.尸体、环境及微生物间相互作用关系复杂,而微生物演替规律的研究依赖于从宏观角度监测各腐败节点菌群组成及群落多样性改变.随着高通量测序(high-throughput se-quencing,HTS)技术的成熟和发展,不同环境中微生物菌群结构和多样性被逐一解读,同时也为探索尸体微生物打开了新的突破口.利用HTS技术挖掘尸体腐败过程中微生物群落的演替规律,诠释各种腐败现象的本质,成为法医微生物学新的研究热点,可为死亡时间(postmortem interval,PMI)推断提供新的参考依据.本文针对利用尸体微生物推断PMI的研究进行综述,基于目前HTS技术在探索腐败微生物演替规律中的应用,探讨该技术在法医微生物学研究中存在的问题及应用前景.
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慢性丙肝患者高通量测序TCR-CDR3免疫组库研究
目的 探讨HCV感染患者外周血TCRβV基因重组的多样性以及发现可识别丙型肝炎病毒的T细胞受体.方法 分离HCV感染患者的外周血淋巴细胞提取RNA,反转录为cDNA一链,进行多重PCR扩增,构建测序文库,进行高通量测序,分析其TCR多样性以及表达的差异.结果 6例HCV感染患者运用Illumina Miseq测序平台测序,去除冗余后的氨基酸序列,得到151246个CDR3有效序列,建立TCR-CDR3免疫组库,将V-J基因结合,得到6个样本均高频配对TRBJ1-1–TRBV19(3.92％),TRBJ1-1–TRBV2(3.17％),,用皮尔森相关系数分析得r=0.83.结论 推测其TRBJ1-1–TRBV19、TRBJ1-1–TRBV2可能参与HCV感染的发病、免疫应答等.
关键词： 丙型肝炎病毒 高通量测序 TCR-CDR3免疫组库 -
第二代测序在肿瘤临床研究中的应用
高通量测序又称下一代测序(NGS)技术,即第二代测序技术.其主要特点是通量高、灵敏度高、信息量丰富、成本低等.NGS技术在基因组从头测序、重测序、转录组学测序及表观遗传学研究中发挥了重要作用.近年来,NGS技术逐渐被应用于研究肿瘤的发病机制、分子分型、诊治手段及预后分析等方面,取得了一系列重大突破.基于NGS技术的肿瘤临床研究必将极大推动以基因大数据与个体化医疗为特征的现代肿瘤精准医学的发展,影响和改变我们的临床实践,给肿瘤患者的生存带来质的突破.
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无创产前DNA检测与传统产前诊断在产前诊断中的临床对比研究
目的 比较无创产前DNA检测与传统的产前诊断在妊娠妇女产前诊断中的临床疗效.方法 选取于2013年3月份至2016年5月份自愿于本院接受无创产前DNA检测的963例单胎的娠妇作为研究对象,对外周围血DNA高通量测序结果异常者进一步采取传统的产前诊断(即羊水染色体核型诊断),并对所有新生儿进行电话随访.结果 963例妊娠妇女完成了无创产前DNA检测,结果异常者共计11例,此中21-三体染色体异常检验阳性者为7例,18-三体染色体异常检验阳性者为3例,13-三体染色体异常检验阳性者为1例.对结果异常的妊娠妇女进行羊水染色体核型诊断,此中7例确诊为21-三体染色体异常,3例确诊为18-三体染色体异常,1例确诊为13-三体染色体异常.以上外周围血游离DNA高通量测序结果与羊水染色体核型诊断结果的相符度为100%.结论 对于妊娠妇女的产前筛查,无创性产前DNA检测对于21-三体染色体异常、18-三体染色体异常及13-三体染色体异常等非整倍体染色体异常的准确率高,与传统的产前诊断相比创伤小,值得在临床中进行推广.
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转录组测序分析吲哚美辛对小鼠小肠类器官的影响
目的 探讨吲哚美辛对小鼠小肠类器官转录组的影响.方法 采用四唑盐比色法检测吲哚美辛对小肠类器官存活率的影响,Illumina Hiseq测序技术筛选吲哚美辛组与对照组小肠类器官之间的差异表达基因,并对差异表达基因进行基因本体(GO)、京都基因与基因组百科全书(KEGG)功能注释与富集分析.结果 四唑盐比色法检测结果显示100,250,300,400,500 μM吲哚美辛作用于小鼠小肠类器官48 h后的存活率分别为80.34％,70.17％,61.94％,54.38％,42.22％.250 μM吲哚美辛作用于小鼠小肠类器官24h、48 h、72 h后的存活率分别为80.56％,70.17％,59.30％.GO富集分析发现在细胞组分分类上,差异表达基因主要富集在微体与过氧化物酶体(P＜0.01),在分子功能组上,氧化还原活性、谷胱甘肽转移酶、羧酸结合是显著富集的类型(P＜0.01),有机酸代谢过程、含氧酸代谢过程与羧酸代谢过程是显著富集的GO生物过程(P＜0.01).KEGG富集分析发现差异表达基因显著富集在化学致癌作用、异源物质细胞色素P450代谢、细胞色素P450药物代谢、PPAR信号通路(P＜0.01).结论 吲哚美辛以时间与浓度依赖性方式抑制小鼠小肠类器官的增殖.小肠类器官可能存在抗氧化应激作用抵御吲哚美辛引起的小肠损伤.逆转氧化应激有望成为非甾体抗炎药小肠损伤的治疗靶点.
