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连作对黄花蒿生长及土壤细菌群落结构的影响
试验采集未种植、种植1年、3年和5年的黄花蒿土壤,利用常规分析和Illumina MiSeq高通量测序技术,研究了连作对黄花蒿生长、青蒿素含量、土壤有效养分和细菌群落结构的影响.结果表明,连作显著抑制黄花蒿生长,降低叶片生物量、青蒿素含量和产量,大降幅依次为30.20％,7.70％,35.58％.黄花蒿连作不同程度地降低土壤有机质、有效氮、有效磷含量和细菌16S rRNA序列数.高通量测序结果显示,在不同种植年限的黄花蒿土壤中,共有634 ～812种细菌,归属于21个门类,代表不同处理年限细菌群落的点在主成分坐标系中分布距离较远,群落结构发生了显著变化(P＜0.05).随黄花蒿连作年限增加,放线菌门、绿弯菌门和芽单胞菌门的丰富度降低,但变形菌门、酸杆菌门和疣微菌门丰度增加.与未种黄花蒿的土壤相比,在种植土壤的前20种优势细菌中,硝化螺旋菌和根瘤菌消失,仅有芽单胞菌、微单孢菌、亚硝化单胞菌、黄色杆菌和不可培养细菌JG30-KF-AS9等5种相同.说明种植尤其是连作黄花蒿选择性抑制了土壤细菌的生长繁殖,影响土壤养分的转化供应,导致黄花蒿生长不佳,青蒿素含量和产量降低.因此,在种植黄花蒿的过程中,提倡轮作很有必要.
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青海上北山林场野生桃儿七根部内生真菌群落组成及多样性研究
该研究通过应用第二代测序技术(NGS),即高通量测序方法测序青海野生桃儿七根内真菌宏基因组ITS 1区,并依据RDP中设置的分类阈值对处理后的序列进行物种分类,鉴定内生真菌的群落组成.研究结果显示,测序结果经过质量控制共获得有效条带22 565条,依据97％的序列相似性做聚类相似性分析,获得全部样品的可分类操作单元(OTUs)共517个,RDP分类依据0.8的分类阈值鉴定出的全部真菌可归类为13纲、35目、44科、55属.3个样品LD1,LD2,LD3中共同的优势属真菌为Tetracladium属(所占比例分别为35.49％,68.55％,12.96％),样品的香浓多样性指数和辛普森多样性指数分别在1.75 ～2.92,0.11 ～0.32.研究结果表明,青海上北山林场野生桃儿七根内内生真菌具有较高的多样性和较复杂的群落组成,蕴含着丰富的内生真菌资源,且高通量测序技术对于研究植物内生真菌群落组成及多样性具有显著的优势.
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川明参轮作对烟地土壤微生物群落结构的影响
土壤微生物是土壤质量的重要指标,为探索川明参种植对烟地微生物影响,该文采用Illumina MiSeq高通量测序研究了川明参对植烟土壤中细菌和真菌在门和属水平上的群落结构变化.结果表明,川明参种植增加了烟地土壤细菌和真菌的生物多样性,且对真菌的影响大于细菌,极大的增加了真菌的序列数,分别获得32 978个细菌16S rDNA序列和32 229个真菌18S rDNA序列.没有改变细菌前三大优势菌门类,但含量上分别使变形菌和酸杆菌降低1.73％,1.4％,放线菌增加0.65％,使真菌优势门子囊菌减少27.99％成为次优势菌,次优势菌担子菌增加23.69％成为优势菌;改变了原烟地属水平的群落结构,使优势属及丰度都发生了变化,变化较大的细菌如uncultured Acidobacteriaceae Subgroup-1,Gemmatimonas,Subgroup-2,uncultured Nitrosomonadaceae等,真菌如norank Sordariales,norank Agaricomycetes,Phialophora等,且拮抗微生物及生理类群微生物丰度增加,病原菌减少.因此,川明参种植能改善烟地土壤微生物.
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西洋参根腐病发生与根际真菌群落变化关系研究
根腐病是西洋参栽培过程中常见的一种病害,分析根际土壤真菌群落与西洋参根腐病间关系,可为解决根腐病问题提供一定线索.该研究利用Illumina MiSeq测序技术,分析了空白地(C组)、健康参根际土壤(N组)和根腐病参根际土壤(R组)样品中真菌群落结构多样性及组成变化.通过测序,共获得高质量序列505968条,样品稀释曲线表明测序深度充足,取样合理.真菌群落主要属于Ascomycota(54.9％),Basidiomycota(5.6％)等9个门,其优势菌门为Ascomycota;MonograPhella(9.3％),Archaeorhizomyces(3.9％),Mortierella(2.9％)等115个属,其优势菌属为MonograPhella.在属水平上,与C和N组相比,R组中MonograPhella和Mortierella丰度均显著增加.α多样性指数表明,与C组相比,N和R组中真菌群落多样性指数降低,真菌种类减少,R组达到小.β 多样性指数表明,各样品中真菌群落结构均存在明显差异.聚类热图显示各样品中菌属差异较大,R组中MonograPhella和Mortierella比例显著高于C和N组,Trichoderma,Penicillium,CadoPhora在R组中所占比例较小;Phoma和Gibberella在R组中较N组中所占比例显著增加.该研究通过分析土壤根际真菌多样性及群落构成变化,表明真菌多样性指数显著降低和群落结构失衡可能导致西洋参根腐病的发生,这为防治西洋参根腐病发生提供了一定的理论依据.
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中药饮片耐热菌微生物类群的分析
探索污染中药饮片的耐热菌微生物组成和多样性特征.以9个品种中药饮片为研究对象,采用MALDI-TOF-MS蛋白质指纹图谱技术和Illumina Miseq的16S rRNA宏基因组高通量测序技术对样品的耐热菌微生物群落进行分析.茎类饮片(鸡血藤、通草、小通草)的污染菌检出率高,种类多;而果实类饮片(南五味子)检出率低,污染菌种类少;根类饮片中,广山药和熟地黄的污染菌检出率和种类偏低.耐热菌微生物类群以芽胞杆菌科和类芽孢杆菌科为主;其中检出率高的菌属为芽孢杆菌属,还包括短小芽孢杆菌属、类芽孢杆菌属、土壤芽胞杆菌属,高通量测序注释的其他菌属为肠杆菌属、短波单胞菌属、明串珠菌属、甲基杆菌属、脱氯单胞菌、泛菌属、克雷伯菌属和欧文氏菌属等.中药饮片的耐热菌微生物群落潜在危害因子,应完善其微生物限度标准,严格控制产品中的致病菌,加强中药饮片在生产和流通环节的监督管理.
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多穗柯转录组分析及黄酮类化合物合成相关基因的挖掘
多穗柯具有甜味和保健功效,其中黄酮类化物是主要活性物质.为获取多穗柯转录组数据库以及黄酮类化合物生物合成相关基因,该研究用RNA-Seq中的Illumina HiSeq 4000对多穗柯嫩叶进行转录组测序,共获得6 Gb数据,拼接后得到41 043条Unigene,与7个基因数据库进行比对,可归类于51个GO分类中,涉及到237个KEGG标准代谢通路.找到黄酮合成相关基因28条.通过MicroSatallite (MISA)软件分析筛选到18 161个SSR,其中单碱基重复丰富,有7 346个.此研究得到大量转录本信息,为多穗柯的分子生物学研究提供了宝贵的转录组数据库资源.
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基于高通量测序的玄参根部转录组学研究及萜类化合物合成相关基因的挖掘
该研究应用新一代测序技术Illumina HiSeqTM 4000在转录水平上对药用植物玄参根部进行测序,结合生物信息学方法开展基因功能注释和SSR位点搜索.通过测序,共获得65 602 036条原始序列.利用生物信息学软件拼接和组装序列,获得73 983条unigene,平均长度823 bp.序列同源性比较表明,56 389条unigene与其他物种具有不同程度的同源性.通过Swiss-Prot,GO,KEGG,COG比对注释,发现520条编码玄参次生代谢途径关键酶基因和191个相关转录因子.利用MISA软件在所有unigenes中共搜索到11 659个SSR位点,重复类型以二核苷酸为主.该研究所获得的参与次生代谢的关键基因可为研究玄参药用成分的生物合成和调控机制奠定基础,获得的大量SSR位点为后续研究玄参种质鉴定及遗传多样性研究提供参考.
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基于转录组测序挖掘国槐花蕾黄酮类物质生物合成相关基因
为研究国槐黄酮类物质的生物合成途径,利用高通量测序技术对国槐花蕾进行转录组测序,经Trinity软件组装获得113 907条unigenes,平均长度803 bp,其中72 752条unigenes在数据库获得注释信息,共搜索到38 891个SSR位点.通过代谢通路分析,发现国槐转录组中有135个unigenes参与黄酮类生物合成,有959条unigene参与其他次生代谢途径.进一步分析参与国槐芦丁生物合成相关基因,发现有24个与CHS相关,有52个与FLS相关,有11个与UFGT相关.国槐转录组数据的获得为研究国槐黄酮类物质生物合成途径奠定了基础,也为槐米药材品质的形成提供理论依据.
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采用高通量测序技术分析尾病毒目噬菌体基因组末端序列特点
证明噬菌体高通量测序中高频出现的序列即是噬菌体基因组的末端序列.在T3噬菌体基因组末端连接特异性序列接头,然后进行高通量测序,同时将不加接头的T3基因组也进行高通量测序,对测序结果进行生物信息学比较分析.采用类似高通量测序技术分析N4样噬菌体的全基因组序列.加接头的序列与无接头序列中的高频序列完全一致,证明了高通量测序过程中得到的高频序列就是加接头的基因组末端序列,同时证明T4样噬菌体的末端具有序列特异性而非完全随机,此外我们还发现N4样噬菌体基因组左侧末端具有唯一序列,而其基因组右侧末端不均一.高通量测序技术方便快捷,可用于噬菌体基因组末端和全基因组序列的同时测定.
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中国广西龙虎山野生猕猴粪便的病毒宏基因组学分析
非人灵长类携带的病毒种类繁多,其中部分对人具有致病性.为深入了解我国野生猕猴携带病毒的状况,本研究应用MiSeq高通量测序及生物信息学分析技术,对从广西采集的280份猕猴粪便标本进行了病毒宏基因组学的分析.高通量测序共获得了233 726 79条读长(Reads),其中4641条序列与病毒相关,进一步注释到27个病毒科(包含细小病毒科中的细小病毒亚科和浓核病毒亚科),包括其中5种脊椎动物病毒(占78.2％)、6种昆虫病毒(占5.5％)、11种植物病毒(占10.4％)、其他的病毒(占9.8％);遗传进化分析结果显示,被注释为萨佩罗病毒、肠道病毒、细小病毒、腺相关病毒等序列与已知病毒相似,部分序列呈现明显的差异;应用PCR扩增进一步证实了病毒序列的真实存在.本研究初步确定了广西地区猕猴粪便中病毒的病毒谱,为深入分析和研究其中有潜在公共卫生意义的病毒奠定了基础.
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基于小RNA(sRNA)深度测序技术进行病毒鉴定和发现的研究进展
sRNA深度测序技术是2009年起新兴的可用于病毒研究的组学技术,它突破了传统病毒鉴定技术的局限,直接以宿主中sRNA (small RNA)为研究对象,可以快速地鉴定侵染宿主的病毒组成.是一种发现新病毒,监控病毒变异的有效方法.人们用这种方法发现了很多有意义的病毒,研究领域涉及到植物、无脊椎动物和人体细胞等,充分显示siRNA组学方法应用在病毒鉴定和分类的实用意义.本文对该方法的主要原理,操作流程及应用进展等方面进行了综述,同时使用公开的sRNA深度测序数据进行了生物信息分析,进一步证实了该方法的可靠性.
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基于高通量测序数据的微生物检测算法
目的 设计一种基于高通量测序数据的功能强大、处理速度快且不依赖于运行环境的本地化的微生物检测算法.方法 对微生物基因组进行分组,每次使用一组微生物基因组提取映射到其上的测序数据并滤除数据中的人类基因组数据,然后对序列进行拼接和拼接片段比对.如果根据比对结果检测出微生物种属则流程结束,否则使用下一组微生物基因组进行分析.若使用所有微生物基因组分析结束后仍未确定微生物种属,则滤除剩余的测序序列中的人类测序数据并进行拼接,拼接片段通过序列比对无法匹配到微生物基因组,则将这些拼接片段归为未知病原微生物的基因组片段.结果 利用新的检测算法对模拟数据和实际测序数据进行分析,以RINS作为对比.对于已知病原微生物,新算法的平均处理时间为75 min,RINS的平均处理时间为767 min,两个算法检测结果一致,新算法得到的拼接序列更长.对于未知病原微生物样本,新算法检测的平均处理时间为64 min,RINS的为584 min,新算法得到了较完整的原始序列.对于实测数据,新算法的平均处理时间为23 min,RINS的为68 min,检测结果一致.结论 本文实现的微生物检测算法能够对微生物进行准确、快速的检测,同时,新的检测算法可以发现未知的微生物并获取未知微生物的基因组片段.
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利用小RNA高通量测序筛查媒介昆虫携带的病原体
高通量测序方法筛查媒介昆虫携带病原体是一种新的重要方法.研究表明小RNA高通量测序可用于昆虫携带病毒的检测.本工作尝试用小RNA高通量测序法筛查昆虫携带的病毒,发现该方法不仅可用于媒介昆虫携带病毒的检测,也可以用于原核和真核病原体的筛查.用该方法对野外采集的3种蚊虫和3种蜱进行分析,用blast程序对NCBI核酸序列库(nt)进行比对搜索,从测序结果中查找到多种病毒、原核及真核的病原体.上述结果表明,小RNA高通量测序可以用于各种病原体的发现,有望发展成为一种通用的病原体筛查技术.
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基于高通量测序数据的人兽共患病病原微生物快速分析平台构建
目的 构建基于高通量测序数据的人兽共患病病原微生物快速分析平台,实现人兽共患病病原微生物的快速分析. 方法 收集整理与重要人兽共患病相关的病原以及宿主的参考基因组数据库,集成并优化用于病原微生物检测分析的RINS算法,开发自动化处理流程和Web可视化界面,利用Docker容器技术对集成分析平台进行封装. 结果 在Linux服务器上使用鸽子宏基因组测序数据对分析平台进行验证,根据分析结果,发现除了有鸽子基因序列外,16.1％的序列注释到了细菌,2.2％注释到了病毒,32.9％的序列注释到了真菌,剩下48.8％为未知序列,对样本中细菌的携带信息进行统计,比对到巴氏杆菌、大肠埃希菌、沙门氏菌的序列数量较多,此结果与数据来源单位中鸽子相关的流行病学研究一致. 结论 本研究成功构建基于NGS的病原微生物检测分析平台,封装好的容器可以在云端快速部署和迁移;对已集成的RINS算法中Blat比对环节进行了优化,提高了数据分析处理速度;利用鸽子宏基因组测序数据对建成的分析平台进行验证,该平台具备人兽共患病病原微生物快速分析的能力.基于NGS的病原微生物检测方法为人兽共患病的防控和监测增添了新的解决方案.
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维吾尔族糖调节受损患者肠道菌群高通量测序初步探讨
目的 比较维吾尔族糖调节受损(impaired glucose regulation,IGR)患者和健康人的肠道菌群分布,分析维吾尔族IGR患者肠道菌群结构及其多样性,探讨IGR患者肠道菌群多样性的改变与糖尿病发生发展的关系. 方法 选取20例糖调节受损维吾尔族患者为IGR组,20例健康人为NGT组,通过Illumia Miseq平台对受试者粪便中的细菌进行16S rRNA V3 V6 区高通量测序,并进行操作分类单元(OTU)聚类分析、多样性及结构分析,比较两组人群肠道菌群的结构、丰度及多样性. 结果 对IGR组和NGT组粪便细菌总DNA的16S rRNA V3-V6区进行高通量测序,获得3269 951条优化有效序列,优化序列平均长度为436.82 bp;分析两组肠道菌群α多样性分析,Sobs指数、Shannon指数、Simpson指数差异均有统计学意义(t=2.173、2.193和2.041,P＜0.05);物种差异分析显示,菌群结构两组在门水平上Saccharibacteria菌门的差异有统计学意义(P＜0.05),在属水平上巨单胞菌属(Megamonas)、瘤胃菌属(Ruminococcaceae)、Barnesiella菌属、萨特氏菌属(Sutterella)、Ruminiclostridium菌属、嗜血杆菌属(Haemophilus)、梭菌属(Clostridiales)、红蝽菌属(Coriobacteriaceae)、Flavoni fractor菌属和Saccha ribacteria菌属等10个菌属差异有统计学意义(P＜0.05).韦荣氏球菌属(Veillonella)、巴斯德氏菌属(Pasteurellaceae)、嗜血杆菌属(Haemophilus)为IGR组区别于NGT的与IGR相关性大的物种;拟杆菌门(Bacteroidetes)与LDL-C呈负相关;软壁菌门(Tenericutes)与臀围和TC呈负相关;软壁菌门与H DL-C呈正相关;放线菌门(Actinobacteria)与BMI呈正相关. 结论 相比NGT组,IGR组的肠道菌群多样性和丰度明显下降,说明拟杆菌门和Saccha ribacteria菌门可能与维吾尔族人2型糖尿病的发生、发展有关.
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全基因测序分析粪肠球菌利奈唑胺耐药相关变异位点的研究
目的 通过全基因组序列研究利奈唑胺敏感株和诱导耐药粪肠球菌之间基因位点差异,分析利奈唑胺耐药相关基因变异位点. 方法 粪肠球菌ATCC29212菌株用浓度梯度的利奈唑胺进行耐药性诱导,终获得利奈唑胺耐药的粪肠球菌株LRS29212.提取其总DNA,进行PE(paired end或称双端)测序,采用软件SPAdes进行序列拼接,拼接获得原始scaffold,然后用Gapcloser及GapFiller对scaffold补Gap,采用PrInSeS-G进行序列校正,终获得全基因组序列.获得的全基因序列与标准株ATCC29212菌株基因组序列(PUBMED公布序列)作比较,获得变异基因位点,并对变异基因功能进行注释. 结果 通过32代诱导,获得了粪肠球菌LRS29212,其MIC值为128 μg/ml;粪肠球菌LRS29212全基因组包含3 010 552碱基对,GC含量37.3％.基因组通过注释后总共有2 918个编码序列(CDS),53个tRNA的编码基因,以及5个完整的rRNA基因编码的操纵子,获得PUBMED全基因序列号(PRJNA257022);总共找出152个SNP,其中错义突变的SNP有24个,包含结合糖ABC转运ATP结合蛋白. 结论 经LZD诱导成功获得耐LZD粪肠球菌LRS29212菌株,测序分析该菌株存在基因突变位点,为进一步研究LZD耐药机制奠定了基础.
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腺病毒41型感染致儿童腹泻一例临床表现及病毒基因组学特征分析
目的 针对消化道疑似感染病例,采用高通量测序技术筛查病原体,并测定其全基因组序列,阐明其基因组及进化特征. 方法 通过对原因不明腹泻患儿的粪便进行病原体高通量基因测序,然后拼接其全基因组序列,采用大似然法(选择bootstrap为1000)绘制主要抗原蛋白六邻体(hexon)、五邻体(penton)和纤维突蛋白(fiber)的进化树,分析进化特征;运用Recombination Detection Program version 4 (RDP4)软件进行序列重组分析;使用软件CLC Genomics Workbench 9.0分析突变位点. 结果 患儿临床表现主要为发热、呕吐、腹泻伴抽搐,通过对腹泻患儿的粪便样品高通量测序,使用本实验室高通量测序数据分析程序检出41型腺病毒(HAdV-41).进一步测序和拼接获得该病毒全基因组序列,其基因组全长34 138 bp.序列比对显示该病毒核苷酸序列与已报道序列的高同源性为99％(Human adenovirus 41 isolate NIVD103),属于腺病毒F亚属.对该病毒六邻体、五邻体和纤维突蛋白进行进化分析,其六邻体与HAdV-41 isolate NIVD103,HAdV-41 isolate SH/2015/D16亲缘关系较近,五邻体与HAdV-41 isolate NIVD103,HAdV-41 isolate SH/2015/D16,HAdV41 isolate SH/2015/D240,HAdV-41 isolate SH/2015/D381亲缘关系较近,纤维突蛋白与五邻体相似;对全基因组序列进行重组分析,未发现明显的重组迹象,但突变分析显示引起此例腹泻的病毒株基因组有多处突变. 结论 从一例腹泻患儿粪便中检出的病原体为新的41型腺病毒,该病毒基因组与以往发现的41型腺病毒有较大差异,其流行态势、致病性及免疫原性值得关注.
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高通量测序用于发现严重感染病原体研究进展
如何能在海量的高通量测序数据中去除噪音、发现致病微生物是一个重要的研究课题.临床信息指导下的高通量测序能减少对于高通量测序海量数据的生物信息学分析工作量,高通量测序指导下的病原体致病性判断又减少了临床撒网式筛查病原体的工作量.高通量测序的临床应用可能使得严重感染的临床治疗更为精准并有效降低死亡率.
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基因表达谱分析有望改善白血病的治疗
在临床工作中将急性髓系白血病(AML)分为预后较好,中度风险和预后较差的不同类型进行治疗.然而,大部分被定于中等风险的AML患者,他们对治疗的反应并不一致,有的治疗反应好,只需接受以化疗为基础的巩固方案,就能获得相对较好的治疗结果,而那些治疗效果不佳、且复发率高的患者,需要在第一次诱导缓解后通过异基因造血干细胞移植来改善预后.通过全基因组测序或者全外显子组测序,可以获得关于白血病细胞基因拷贝数改变、甲基化改变、mRNA和microRNA的表达特征谱等多种信息,整合和利用这些基因表达谱的综合信息,可以对白血病亚型进行更准确的分类,从而更有针对性的确定恰当的治疗方案,在诊断之初就能准确地判断预后.对白血病细胞基因表达谱分析不仅可以对疾病深入的认识,还能作为研发靶向药物的依据,获得效率更高,更特异性的药物,改善疾病结局.
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高通量测序在FLT3-ITD阳性急性髓细胞白血病患者中的应用
目的:探讨高通量测序在FLT3基因ITD突变含量较低及存在多条ITD突变的初诊急性髓细胞白血病(AML)患者ITD序列分析中的应用,并分析ITD突变特点.方法:采用聚合酶链反应(PCR)扩增23例FLT3-ITD阳性AML患者FLT3基因,应用毛细管电泳法分析FLT3基因ITD突变,然后用带有不同序列标签的PCR引物再次扩增上述患者FLT3基因,应用illumina Miseq二代测序仪分析扩增产物,并将测序结果与UCSC数据库比对.结果:23例AML患者毛细管电泳检测显示,17例患者为1条ITD插入突变,3例患者为2条ITD插入突变,3例患者为3条ITD插入突变.高通量测序共检测到的33条ITD中17条ITD插入序列为FLT3野生型完全重复,16条ITD为野生型部分重复.1例伴多条ITD患者同一插入长度存在两种ITD序列,另外1例伴有2条ITD为同一ITD插入位点.ITD插入序列发生在p.Y572位至p.L602位之间,所有患者ITD均覆盖p.V592-p.E598之间的一个或多个氨基酸.结论:Illumina Miseq二代测序仪可灵敏、准确地分析FLT3-ITD序列,FLT3-ITD序列特征变化较大但突变热点区域较为集中.
