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一例AML-M2患者初发和缓解期转录组测序SNV结果比较分析
本研究旨在进一步阐明急性髓系白血病的发病机制,筛选新的肿瘤特异性突变.利用高通量测序的方法对1例初诊的部分分化型急性髓系白血病(AML-M2)患者发病期及缓解期外周血样本进行转录组测序,通过对初诊时和缓解后表达基因的比较,筛选可能与白血病发生相关的单核苷酸变异(SNV).结果表明:Reads在基因上分布均匀,覆盖完整,检测到大部分基因的表达.通过对SNV的筛选,共检测到29881个基因突变,包括28113个种系突变和752个体突变,其中编码区获得性突变11个(P＜0.05),包括ZRSR1、MLXIP、TLN1、LAP3、HK3.结论:高通量测序作为一种无偏的检测基因突变的新方法,可以发现肿瘤相关新突变.MLXIP可能是AML M2新的分子标志物.
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应用高通量测序技术快速鉴定未分型甲型流感病毒
目的 利用Ion Torrent半导体二代测序技术开展禽类和外环境中禽流感病毒基因组测序和亚型的快速鉴定,建立快速鉴定未分型甲型流感病毒亚型的高通量测序方法.方法 提取9份禽类拭子和外环境标本中的病毒RNA,进行甲型流感病毒通用型、H5N1亚型、H7N9亚型和H9N2亚型荧光定量PCR检测;利用PathAmpFluA试剂盒对病毒RNA进行全基因组扩增,利用Next Fast DNA Fragmentation & Library Prep Set for Ion Torrent试剂盒进行文库制备,并在Ion torrent二代测序仪上完成测序;采用Ion Torrent Suite v3.0进行测序数据提取和质量评估,并且用FluAtyping v4.0和PathogenAnalyzer两个插件进行流感序列拼接和数据库比对,终确定9份禽流感标本的流感病毒亚型.结果 9份禽类拭子和外环境标本甲型流感病毒核酸阳性但常规监测的H5N1、H7N9和H9N2亚型均为阴性,经二代测序和生物信息学分析共鉴定出7种亚型:H2N3、H5N6、H5N8、H7N1、H7N7、H11N3亚型流感病毒阳性标本各1个,H6N6亚型流感病毒阳性标本3个.结论 浙江省外环境中禽流感病毒亚型众多,Ion torrent半导体测序技术适用于禽及外环境监测中发现的未分型甲型流感病毒亚型的快速鉴定.
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1例上呼吸道感染病例的高通量测序病原鉴定
目的 以高通量测序技术对1例上呼吸道感染病例的可能病原进行鉴定并对样品前处理方法进行优化.方法 以核酸酶和/或核糖体RNA探针杂交预处理患者咽拭子样本,非序列依赖单引物扩增(sequence-independent single primer amplification,SISPA)后制备测序文库,利用MiSeq高通量测序,对测序结果进行生物信息分析及Real time RT-PCR验证.结果 测序reads经拼接后与病毒数据库比对发现存在乙型流感病毒序列,进化分析该毒株属于Yamagat系一株新的变种,核酸酶结合核糖体RNA探针杂交处理样本可提高高通量测序目标序列数及覆盖率.结论 应用核酸酶和/或核糖体RNA探针杂交处理样本结合高通量测序技术可用于快速高效地鉴定不明原因感染的病原.
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基于高通量技术的SFTS病毒基因组测序方法的建立
目的 建立一种基于高通量测序技术的发热伴血小板减少综合征病毒(svvere fvver with thrombocytopenia syndrome virus,SFTS)基因组的测序方法.方法 提取SFTS病毒核酸,分别采用随机引物和oligo (dT)磁珠特异性抓取核酸的方法,优化扩增和纯化条件并建库,利用二代测序仪检测病毒核酸序列.结果 3株病毒采用两种方法测序结果差距较大,利用随机引物建库法获得的数据测序深度和覆盖度明显低于oligo(dT)磁珠抓取建库法.采用oligo(dT)磁珠抓取建库的方法,可对提取的核酸大于300ng的毒株进行测序,3株病毒测序深度都在900以上,覆盖度均超过99％,与NCBI上数据匹配度在90％以上.结论 利用oligo(dT)磁珠抓取SFTS病毒核酸的方法 进行建库,建立了基于二代测序平台的SFTS病毒基因组检测方法.
关键词： 发热伴血小板减少综合征病毒 文库构建 高通量测序 基因组 -
不同浓度乙型肝炎病毒全基因组高通量测序方法的建立及其应用
目的 建立一种适用于不同浓度乙型肝炎病毒(hepatitis B Virus,HBV)的全基因组高通量测序方法.方法 分别采用HBV病毒核酸直接建库方法及巢式PCR扩增建库方法,对含高、中、低HBV拷贝的3个血浆样本进行文库构建.通过Illumina Miseq平台对HBV全基因组进行高通量测序.结果 基于两种不同建库方法获得数据产量差异巨大.HBV病毒核酸直接建库方法只有很少数据可以匹配到HBV基因组.巢式PCR扩增能够成功扩增出HBV全基因组,文库经高通量测序后,HBV基因组匹配率接近80％,且样本覆盖度和深度不受HBV浓度影响.3个不同浓度HBV样本共发现27个宿主内单核苷酸突变(intra-host single nucleotide variations,iSNVs),其中13个是低频突变.逆转录(reverse transcription,RT)区域的突变出现在低拷贝数和中等拷贝数样品中,而在高拷贝数样品中没有发现.结论 本研究建立的巢式PCR扩增结合高通量测序对HBV全基因组测序的方法,不仅可以快速准确的检测HBV感染,还可以发现低拷贝样品中整个HBV基因组的突变.
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高脂饮食对大鼠肝脏功能及肠道细菌群落的影响
目的 通过高脂喂养大鼠构造动物模型,探究高脂饮食对肝脏功能及肠道细菌群落的影响.方法 将20只21日龄大鼠随机均分成两组: 正常组和高脂组.正常组饮食普通饲料,高脂组饮食高脂饲料. 6周之后,提取两组大鼠粪便对肠道细菌群落进行16S rRNA高通量测序分析.结果 6周之后,与普通饮食大鼠比较,高脂饮食大鼠血液中总蛋白 (TP 55. 79±3. 75) (P=0. 002)、球蛋白 (GLB 34. 9±2. 53) (P<0. 001)、白蛋白 (ALB/GLB 0. 60±0. 02) (P<0. 001)、碱性磷酸酶 (ALP 373. 80±63. 05) (P<0. 001)、总胆固醇 (TC 1. 94±0. 23) (P<0. 001)、低密度脂蛋白 (LDL 0. 76± 0. 93) (P<0. 001)、 LDL/高密度脂蛋白 (HDL 1. 43±0. 22) (P<0. 001) 和三酰甘油 (TG 1. 48±0. 50) (P=0. 015) 均显著升高.高脂饮食后,大鼠肠道细菌群落多样性和均匀性降低.大鼠肠道细菌中的优势门为拟杆菌门 (平均相对丰度为56. 36%)、厚壁菌门 (35. 31%) 和变形菌门 (6. 61%).其中,拟杆菌门在高脂组中的相对丰度明显降低 ( P=0. 007),厚壁菌门的相对丰度在高脂组中明显升高(P=0. 020),而变形菌门的相对丰度在两组中没有变化 (P=0. 928).此外, 16S rRNA高通量测序分析发现正常组和高脂组大鼠肠道细菌群落结构存在着显著差异.结论 高脂饮食能导致肠道细菌群落结构的改变,并进一步导致肝功能受损,并引发肥胖的形成.
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基于Ion Torrent的乙肝病毒耐药基因突变检测方法的建立与初步分析
目的 建立可用于指导临床用药的HBV耐药基因位点高通量测序检测方法.方法 设计可覆盖全部耐药位点的区域的高通量测序建库引物,利用耐药位点区域存在差异的乙肝基因组质粒梯度混合模拟样品对高通量测序方法的突变率检测能力进行评价.结果 建立了适用于ion torrent平台的扩增子文库构建方法,该方法可对HBV＞100 IU/ml的血清进行建库,对模拟样中突变率在5％以上的位点可很好地检出(信噪比＞10).结论 初步建立了高通量测序检测HBV耐药突变的检测方法,为临床动态监测乙肝病毒耐药区域变异、指导临床合理用药奠定了基础.
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无创产前基因检测技术的临床应用价值
应用母血中胎儿游离的DNA检测胎儿非整倍体技术已开始应用于临床，这一技术与传统的产前筛查和诊断技术相比，具有无创、快速、准确等优点，它是产前筛查和诊断领域的一次革命。本文通过对比分析现有研究资料，评估无创产前基因检测技术在临床应用价值。
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高通量测序技术在智力障碍/全面发育迟缓中的临床应用
智力障碍是一组常见的神经发育障碍性疾病,基因型和表型的异质性都很高,对其的明确诊断越来越依赖全基因组范围内的分子诊断.基于高通量测序(NGS)的panel测序,全外显组测序甚至全基因组测序在智障的分子诊断上都有很好的应用,推荐家系全外显组测序,特别是家系全外作为首选检测方法.针对智障的的NGS数据分析以及重分析对诊断有临床意义,可以可靠检测出基因组内的小尺度突变及拷贝数变异.因此有可能会成为下一个推荐的智障分子诊断技术.
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宏基因组测序在感染性疾病病原体检测中的应用
感染性疾病的致病因素复杂,临床表现多样.快速、全面、准确地鉴别病原体,是临床医生及时、有针对性地采取治疗措施的前提.传统的病原体检测方法目标单一、耗时长、操作复杂,很难满足当今感染性疾病诊治的要求.宏基因组测序技术克服了多数病原体不能培养的弊端,能够准确高效地获得全部病原体遗传物质信息,直接检测出感染性疾病的病原体,对疑难感染性疾病的诊断具有重要参考价值.本文对宏基因组测序在感染性疾病病原体检测中的新研究进展和应用进行综述.
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诺如病毒实验室诊断现状与展望
诺如病毒是引起非细菌性急性胃肠炎的主要病因,常常引起严重的公共卫生与食品安全问题.诺如病毒基因组的多样性及其它们不断的进化和变异为临床诊断及疫苗研制带来了挑战.本文就诺如病毒实验室诊断方法的研究进展作一综述,包括从传统经典的核酸检测到应用纳米、芯片等高新技术的多重核酸定量检测和高通量测序平台,以及体外成功培养的报道等等.这些新技术的成功运用将推动诺如病毒实验室诊断的新发展,以满足临床诊疗及疫苗研制的新需求.
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植物发酵液对肠易激综合征患者肠道菌群的调节
目的:通过高通量测序方法研究植物发酵液(plant fermented extract,PFE)对肠易激综合-(irritable bowel syndrome,IBS)患者肠道菌群的影响.方法:分别收集PFE作用0d和30 d的人体粪便样本,采用Illumima系统MiSeq平台对PFE作用前后的样本进行16S rRNA测序,分析肠道菌群的结构和丰度.结果:PFE作用后,IBS患者的肠道菌群多样性无显著变化.在门水平上,硬壁菌门(Firmicutes)丰度显著降低(P＜0.01),拟杆菌门(Bacteroidete)和变形菌门(Proteobacterias)的丰度以及Bacteroidetes/Firmicutes的比值增加.在佳分类水平(科水平)上,PFE作用后的粪便肠道菌群中检测到弯曲菌科(Campylobacteraceae)、蟑螂杆状体科(Cryomorphaceae)、丹毒丝菌科(Erysipelotrichaceae)和纤维杆菌科(Fibrobacteraceae),且丰度变化具有显著差异(P＜0.05).结论:PFE能够改善IBS患者肠道菌群丰度,调节肠道菌群,可能在IBS疾病的诊断和治疗中具有重要作用.
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目标基因捕获测序技术检测肺动脉高压致病基因突变的研究
目的:利用目标基因捕获测序技术,对9例肺动脉高压(PAH)患者进行4个已知致病基因突变筛查,探讨利用目标基因捕获测序技术对PAH进行基因诊断的可行性.方法:抽取PAH患者外周血,提取全基因组DNA,制备文库.设计骨形成蛋白2型受体(BMPR2)、激活素受体样激酶1(ACVR1)、细胞内皮糖蛋白(EnG),信号蛋白SMAD4基因(SMAD4)外显子区域特异性捕获探计,利用目标基因捕获技术,进行杂交,富集目标基因组区域的DNA片段,利用Illumina HiSeq 2000进行高通量测序,分析致病基因突变与PAH的相关性.结果:9例患者中,2例患者发现BMPR2基因突变,1例发现ACVRL1突变,BMPR2突变临床症状较重,ACVRL1突变发病年龄较小.结论:本研究利用目标基因捕获测序技术,在9例PAH患者中查出3个致病基因突变.该方法快速有效,可实现对PAH致病基因突变的初步筛查,对PAH的临床基因诊断具有重要价值.
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目标基因捕获测序技术鉴定肥厚型心肌病致病突变的研究
目的:利用目标基因靶向捕获高通量测序方法鉴定肥厚型心肌病(hypertrophic cardiomyopathy,HCM)致病突变,并进行基因型-临床表型的分析,以期对临床诊治提供参考依据.方法:连续收集10例HCM患者血液与临床资料.提取全血基因组DNA、文库制备,靶向富集8个编码肌小节蛋白的HCM的致病基因,并行高通量测序.结果:10例患者[平均年龄为(46±7.9)岁,女性占50％]中,4例患者发现5个基因突变位点.双突变(TNNT2 R286H和MYH7 R663H)携带者具有HCM家族史,发病早,左心室重度肥厚,心电图呈现传导阻滞.MYBPC3 D770N和MYBPC3 S236G突变携带者发病年龄晚,左心室肥厚程度较轻.MYH7 R869C突变携带者年龄大,左心室肥厚程度较重,心电图呈现明显左心室肥大证据.结论:对10例HCM患者利用目标基因捕获测序技术筛选出5个致病突变.携带不同突变的患者其临床表型不一致,这对患者的预后和治疗提供了有利的依据.
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17岁男性猝死运动员新基因位点报道
临床资料 患者,男性,17岁,学校田径运动员,主要从事跳高运动,身高189cm,体质量65kg,每天3～4h进行高强度体育训练.2017年6月27日,晨起站立后,突然意识丧失倒地,不能唤醒,家人呼之不应,颈动脉未扪及搏动,立即开始心外按压心脏复苏.120救护车医护人员赶到现场,心电图提示:窦性停搏,室性逸博心律,血压测不出,医护人员继续实施心外按压和面罩辅助呼吸,5 min后恢复窦性心率和自主呼吸,当地医院检查头部和肺部CT正常,冠状动脉CTA正常,心脏超声未提示心脏结构和功能无异常,给予高压氧舱治疗后出院.
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RYR2基因新突变致心源性猝死一家系研究
目的 以1例心源性猝死(sudden cardiac death,SCD)案例为研究对象,寻找与SCD相关的致病基因突变.方法 对1例SCD病例样本及其直系亲属样本,通过靶向二代测序检测相关基因的外显子,并通过Sanger测序对结果 进行验证.结果受检者携带RYR2基因上的错义突变c.G4107C(p.E1369D),该突变位于RYR2基因的第31号外显子,第1369位谷氨酸(E)变成天冬氨酸(D).受检者亲属中该突变的携带者均存在劳动性呼吸困难、胸痛等症状.结论 RYR2基因上的错义突变c.G4107C(p.E1369D)可能是一个导致心源性猝死的致病突变.
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遗传性疾病致病基因检测报告的解读
随着基因测序成本的降低和生物信息学数据分析的日趋完善,特别是结合目标区域捕获技术,高通量测序技术已逐步走向了临床应用,尤其是在孟德尔遗传病的致病基因检测中应用日趋广泛,很多单基因病已经可以进行基因诊断.从个体基因突变信息到临床基因诊断是一个综合的分析判断过程.本文从四个方面详细地讨论了影响基因检测结果临床解读的关键因素,包括基因检测的临床目标效益、基因检测的变异分析要点、基因检测结果与临床表征的综合判断及基因检测的伦理问题.希望能够对研究者或检测机构在遗传病致病基因结果解读的过程有所启发,推动国内基因检测报告的规范化和基因诊断事业的有序发展.
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家族性胸主动脉瘤－夹层致病基因鉴定及表型特征研究
目的：对两个汉族家族性胸主动脉瘤－夹层家系进行致病基因筛查，同时总结家系临床表型特征。方法使用全外显子捕获＋高通量测序对家系成员进行致病基因鉴定。临床表型检查参照马方综合征和家族性胸主动脉瘤－夹层已报道的表型特征，由心外科医师和遗传学专家共同实施。结果 TAA01家系检测分析后得到4个已知可能致病的变异位点：FBN1（ rs140598）， MYH11（rs185661462），MYLK3（rs77620762），TGFBR1（rs111426349）。 Sanger法证实TGFBR1（c．1459C＞T）与该家系胸主动脉疾病呈共分离。早发的主动脉窦部扩张是该家系内一显著特征，家系内6位主动脉窦瘤／扩张患者平均发病年龄为23.2岁。 TAA02家系致病基因为ACTA2（c．445C＞T），伴皮肤网状青斑改变。结论 TGFBR1（c．1459C＞T）和ACTA2（c．445C＞T）分别为两胸主动脉瘤－夹层家系致病基因。对于TGFBR1突变（c．1459C＞T）导致的FTAAD，早发的主动脉窦部扩张较为显著。 ACTA2基因突变伴发的网状青斑样改变得到证实。
关键词： 家族性胸主动脉瘤及夹层 外显子捕获 高通量测序 TGFBR1 ACTA2 -
高通量测序技术在妇产与遗传学科方面的应用
高通量测序技术的发展,为临床医学的进步带来革命性的意义.该技术在诸如产前遗传筛查与产前诊断、流产查因、体外辅助生殖和妇科肿瘤等妇产与遗传学科领域的应用已受到广泛认可.产前遗传筛查是预防出生缺陷的重要手段,以无创产前基因筛查为代表的高通量测序技术具有高灵敏度和高特异度等特点,现广泛应用于染色体非整倍体如21、18和13三体综合征筛查.随着该技术的发展,染色体微缺失/微重复及单基因病的产前遗传筛查无疑是无创产前基因筛查的下一个临床应用热点.此外,高通量测序技术既可精确排查流产的遗传学因素;又可用于胚胎植入前筛查与诊断,极大提高试管婴儿的移植率、妊娠率;还可为妇科肿瘤的早期筛查、分型诊断、复发监测和个体化治疗等方面提供合适的临床方案.总之,高通量测序技术具有高通量、高准确度等优点,在妇产与遗传学科领域具有重要的临床应用价值.
关键词： 高通量测序 产前遗传筛查与产前诊断 胚胎植入前遗传筛查 妇科肿瘤 -
高通量测序技术在低龄孕妇胎儿染色体非整倍体疾病无创产前检测中的应用研究
目的 探讨传统血清学筛查、超声筛查及HTS检测应用于染色体非整倍体产前检测的检测效率,评价HTS及联合筛查对胎儿染色体非整倍体疾病检测的灵敏度和特异度及临床可行性.方法 收集2013年1月1日至2013年12月31日进行HTS检测的低龄孕妇资料1612例.本研究以核型分析为金标准,血清学筛查高风险、超声筛查异常或HTS检测阳性者在知情同意基础上进行核型分析.其余病例随访至胎儿出生后.结果 血清学筛查、超声筛查、HTS对低龄孕妇胎儿染色体非整倍体疾病检测的灵敏度分别为65％(13/20)、24％(6/25)、92％(23/25),特异度分别为42.52％(608/1430)、91.50％(1442/1576)、99.56％(1569/1576),阳性预测值分别为1.56％(13/835)、4.29％(6/140)、76.67％(23/30).超声联合血清学筛查、超声联合HTS的检测灵敏度分别为68％(17/25)、96％(24/25),特异度分别为40.55％(647/1576)、91.24％(1438/1576),阳性预测值分别为1.78％(17/954)、14.81％(24/162).结论 HTS检测T21、T18的灵敏度高、假阳性率低,而且HTS可以检测13、X、Y染色体非整倍体等目前血清学筛查无法检测的染色体疾病,因此HTS检测应用于胎儿染色体非整倍体的产前筛查具有临床可行性;与血清学筛查、超声筛查相比,HTS检测效率较高,且无孕周限制,可避免因较高假阳性而造成的不必要的侵入性产前诊断;相比于超声联合血清学筛查,超声联合HTS具有更高的灵敏度、更低的假阳性率,可以缓解产前诊断工作的压力.
