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1例胎儿羊水过少的基因诊断及植入前诊断
目的 通过高通量测序的方法 ,检测超声发现的1例孕25+周双肾回声增强、羊水过少的胎儿遗传学致病因素.并对该家系进行下一胎的遗传风险评估及再生育指导.方法采用父母胎儿核心家系医学外显子测序技术分析可能的致病突变,并针对发现的突变位点进行植入前诊断.结果 发现异常胎儿ACE基因复合杂合变异c.1028G>A(p.W343*)和c.2948T>C(p.L983P),分别来自父亲和母亲.c.1028G>A变异可导致肽链合成提前终止,生成比野生蛋白少963个氨基酸的截断蛋白,且在相关病例中报道过.c.2948 T>C变异为错义突变,生物信息学预测提示为有害突变,为本研究发现的新突变.植入前诊断结果提示第三次妊娠胎儿未携带父母双方的变异位点,且超声提示未见肾脏和羊水量的异常.结论 通过核心家系的高通量测序,本研究发现了A CE基因1个已报道突变,1个没有临床病例报道过的单碱基变异,结合A CE基因已知的功能学研究和该家系临床表现、遗传规律及后续的植入前诊断结果,提示这2个变异位点很可能是该家系的致病原因.
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非综合征性遗传性耳聋的基因诊断进展
非综合征性耳聋是感官缺陷中常见的一类疾病.耳聋基因诊断正在经历从一代测序到各种高通量测序平台的技术变革 ,针对不同人群有相应的检测手段.基因诊断对于早期发现、早期预防、耳毒性药物应用及生育风险评估有重要指导意义.
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孕妇血浆游离核酸高通量测序检测胎儿遗传异常
孕妇血浆中胎儿源性的游离DNA的发现,为无创产前检测(noninvasive prenatal testing,NIPT)奠定了科学基础.通过对孕妇外周血中的游离DNA进行检测,能够以无创的方式分析胎儿的遗传特征,为产前筛查(prenatal screening)和产前诊断(prenatal diagnosis)提供了有效的手段.新一代高通量测序技术(nextgeneration sequencing,NGS)的发展及其在临床的广泛应用,使其在孕妇血浆胎儿游离DNA检测中的应用成为必然趋势,并推动无创产前检测技术的迅猛发展.通过孕妇血浆游离DNA的高通量测序,可实现胎儿的染色体非整倍体、单基因遗传疾病、微缺失微重复的检测,也可以对胎儿基因组、DNA甲基化组以及转录组等信息进行分析.
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地中海贫血无创产前诊断策略新进展
地中海贫血是中国南方地区高发的单基因遗传病,携带率、发病率高,目前无根治手段,对患儿家庭带来沉重负担,目前首要预防措施是借助有创产前诊断方法取得胎儿组织并进行分子诊断,预防重型地中海贫血患儿出生.但羊水穿刺、绒毛活检等方法具有损伤胎儿风险,时间窗较窄.而无创产前诊断方法使用孕妇血浆游离DNA检测具有早期、精准、快速、无创、痛苦小等优势.随着无创产前检测技术应用于临床,单基因病无创产前诊断对于地中海贫血的防控具有重要意义.高通量测序是目前重要的无创产前检测技术平台,而数字PCR同为高通量的数字化定量工具,成本更加低廉,基于两种平台产生的诊断策略,对于多种单基因遗传病的无创产前诊断有启示意义.本文主要介绍高通量测序及数字PCR两种数字化定量平台及其相关无创产前诊断策略进展.
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母胎医学领域高通量测序遗传检测新技术及其临床效度分析
随着基因组分析技术发展,基于高通量测序的新型遗传检测技术已经开始应用于母胎医学实践.本文将介绍高通量遗传检测技术、其临床应用效度评估的主要内容、评估指标及其影响因素;同时也将介绍目前几项代表性的新型高通量遗传检测技术的临床效度研究情况.通过系统深入研究与评估,将有助于这些新型技术在母胎医学领域的应用得到完善与规范.
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高通量测序在遗传病临床基因检测中的效果评价
基于国内外迅猛发展的高通量测序技术(第二代测序技术)应用以及精准医学的需求,从技术和成本角度分析高通量测序技术用于同时检测单核苷酸变异(SNV)和拷贝数变异(CNV)的临床应用价值.
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植入前遗传学诊断和筛查的新进展
植入前遗传学检测发展早期受技术局限性以及伦理等问题影响，发展缓慢。近年来，随着人类胚胎学和人类基因组学的快速发展，一系列诸如囊胚活检，玻璃化冻存，芯片检测技术以及第二代测序等高新技术的应用，很大程度上解决了早期限制其应用的各种问题，为其应用和推广打开了崭新的局面，但同时又带来新的问题。本文从胚胎学家的视角回顾了植入前遗传学检测的历史，发展过程中涉及的关键因素以及新技术应用可能带来的影响及局限性。
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高通量测序胎儿染色体非整倍体筛查方法在双胎妊娠中的应用
目的 探讨高通量测序用于胎儿染色体异常产前筛查在双胎妊娠胎儿非整倍体染色体异常产前检测中的应用价值.方法 选择妊娠15～18周接受孕中期血清学筛查和核型分析的200例双胎孕妇,妊娠12～27周行非侵入产前诊断(NIPT),对于染色体异常风险度升高者行双胎妊娠羊膜腔穿刺染色体核型分析;未提示风险度升高者,分娩时留取脐血检查有无染色体异常;双胎妊娠出现流产等不良妊娠结局者,留取胎儿组织提取DNA等进行高通量测序及染色体核型分析.以胎儿/新生儿染色体核型分析结果为金标准,分析NIPT结果.结果 200例双胎妊娠患者,行孕中期血清学筛查155例(77.5％,155/200),45例(22.5％,50/200)因年龄高风险未行血清学筛查.155例血清学筛查中,高风险孕妇13例(8.4％,13/155),核型分析和妊娠结局均未发现异常.200例NIPT显示,1例性染色体异常(0.5％,1/200),染色体核型分析证实双胎之一胎儿核型为45,XO;1例18-三体综合征高风险(0.5％,1/200),双胎核型未见明显异常;1例21-三体高风险(0.5％,1/200),双胎之一核型为47,+21,XN;余197例染色体核型分析未提示明显异常.结论 高通量测序胎儿染色体异常产前筛查在双胎胎儿染色体非整倍体的检测有一定的应用价值.
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高通量测序技术检测96例稽留流产组织染色体核型异常分析
目的 采用高通量测序技术检测稽留流产绒毛组织染色体,探讨稽留流产与染色体异常的关系.方法 留取96例稽留流产绒毛组织,采用高通量测序技术检测稽留流产绒毛标本的染色体异常情况.结果 96例稽留流产中,染色体异常31例(32.29％),其中染色体三体异常22例(22.92％),相关染色体拷贝重复9例(9.38％).常见的染色体异常为特纳综合征6例(6.25％),其次为4号-三体4例(4.17％),16号-三体4例(4.17％),21-三体4例(4.17％),18-三体1例(1.04％).9例染色体拷贝重复中,12号染色体短臂合并19号染色体长臂拷贝重复1例(1.04％),3号染色体短臂拷贝重复1例(1.04％),4号染色体短臂拷贝重复1例(1.04％),1号染色体长臂拷贝重复1例(1.04％),1号染色体短臂拷贝重复1例(1.04％),13号染色体合并17号染色体长臂拷贝重复1例(1.04％),8号-三体合并短臂重复1例(1.04％),12号染色体长臂重复1例(1.04％),7号染色体长臂重复1例(1.04％).结论 稽留流产与染色体异常的关系密切.采用高通量测序技术检测稽留流产绒毛染色体成功率高,可以对全基因组覆盖性检测并发现染色体非整倍体异常.
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复发性流产染色体异常及影响因素分析
目的 探讨复发性流产染色体异常及影响因素.方法 选取2015年1月至2017年11月在郑州大学第二附属医院就诊的复发性流产患者73例,其中52例清宫术后新鲜绒毛组织同时行G显带染色体核型分析和高通量测序(NGS)检测;21例因自然流产或药物流产后绒毛组织行NGS检测,其父母均行外周血染色体核型分析.结果 ①52例清宫术后绒毛染色体核型正常37例,数目异常15例;NGS检测正常14例(26.9％),数目异常7例,数目异常且存在拷贝数变异(CNV)7例,仅存在CNV＞ 10 Mb的重复或缺失24例;1例染色体核型分析为45,XO,NGS结果为正常.21例自然流产后绒毛仅行NGS患者中,数目异常5例,CNV＞ 10 Mb的重复或缺失2例,正常14例.73例患者中,父方染色体均正常,母方染色体异常4例(5.5％),其中2例染色体平衡易位者胚胎染色体分别为14-三体合并CNV和7-三体,1例染色体平衡易位和1例10号染色体长臂内倒位者胚胎染色体正常.②73例患者中,年龄≥35岁者绒毛染色体异常发生率(76.7％,23/30)高于年龄＜35岁者(53.5％,23/43)(P=0.044).自然流产3次者绒毛染色体异常发生率(73.3％,33/45)高于自然流产≥4次者(46.4％,13/28) (P=0.021);排除胚胎染色体异常因素后,自然流产≥4次者自身免疫抗体阳性率(60.0％,9/15)高于自然流产3次者(8.3％,1/12) (P=0.006).结论 高通量测序技术可检测染色体微粒缺失,高龄是引起复发性流产胚胎染色体异常的高危因素,自然流产≥4次者自身免疫抗体阳性率增加.
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幽门螺杆菌感染对儿童肠道菌群的影响
目的 通过对比感染幽门螺杆菌的儿童与未感染幽门螺杆菌儿童的肠道菌群组成之间的差异,探讨幽门螺杆菌感染给儿童肠道菌群组成带来的影响.方法 8例感染幽门螺杆菌患儿和8例未被幽门螺杆菌感染儿童的粪便标本,经过基因组提取,对16S rRNA基因V4-V5区进行扩增,构建小片段文库,进行高通量测序,下机数据经过生物信息学处理得到有效序列.比较分析两组间肠道菌群组成的差异,寻找因幽门螺杆菌感染引起显著变化的物种.结果 幽门螺杆菌感染组OTUs较幽门螺杆菌阴性组明显减少,两组之间生物多样性差异显著,感染组的Caproiciproducens属、肠杆菌科、肠杆菌目、Blautia-obeum种、Esherichia-albertli种、人消化道宏基因组、Dorea属水平显著高于阴性组;阴性组未分类拟杆菌种、拟杆菌科、拟杆菌属水平均显著高于幽门螺杆菌感染组.结论 幽门螺杆菌感染对儿童肠道菌群有显著影响.
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人肾癌细胞株miRNA表达差异临床意义研究
目的 miRNA的异常表达会导致肿瘤包括肾癌的产生与增殖.但是miRNA如何促进肾细胞癌的产生与增殖目前仍不十分明确.本研究旨在比较769-P人肾癌细胞株与正常肾组织中表达的miRNA,找出表达差异的miRNA.进一步研究这些表达差异的miRNA在肾细胞癌中表达的临床意义.方法 采用高通量测序技术检测769-P人肾癌细胞株与正常肾脏组织中的miRNA进行测序并对比,比较两者miRNA的表达差异.同时选取2015-06-02-2017-07-02厦门市第二医院20例肾透明细胞癌及癌旁组织(距离组织1 cm),镜下证实为正常的肾脏组织的临床液氮保存标本.进一步比较miRNA在肾透明细胞癌与正常肾组织中的表达差异.结果 769-P人肾癌细胞株与正常肾脏组织中的miR-NA进行测序对比后共检测到19个表达差异有统计学意义的miRNA,均P＜0.05.其中miR-141-3p和miR-199a-5p在769-P人肾癌细胞株中表达明显低于正常肾组织,两者相比差异有统计学意义,P值分别为0.0 218和0.0 069.进一步研究发现,19个miRNA在肾透明细胞癌与正常肾组织仅有miR-141-3p和miR-199a-5p表达差异有统计学意义,P值分别为0.0 057和0.0 369.结论 肾癌中异常表达的miRNA很多,其作用机制复杂,不明确.肾癌中miR-141-3p和miR-199a-5p表达下降促进肾透明细胞癌的增殖,可能成为一类新的临床诊断与基因治疗的分子标志物.
关键词： miR-141-3p miR-199a-5p 肾透明细胞癌 高通量测序 -
急性髓系白血病相关基因差异表达分析并文献复习
目的 探讨急性髓系白血病(AML)相关基因表达水平在白血病发生过程中的作用,进一步阐明AML可能的发病机制.方法 采用高通量测序技术对1例急性髓系白血病部分分化型(AML-M2)患者初诊时及缓解后外周血样本进行转录组测序,统计表达基因及差异表达基因,并对差异表达基因进行基因本体论(GO)和基因所在的代谢通路(KEGG pathway)富集分析,对白血病相关基因JAK1、JAK2、TET2、ASXL1、IDH2、WT1、BCR、ABL1、JAK3、GATA2、HOXA9、FLT3、IDH1表达情况进行筛选分析.结果 该AML-M2患者外周血中WT1、BCR、ABL1、JAK3、GATA2、HOXA9、FLT3、IDH1为差异表达基因.结论 高通量测序技术可检测疾病某一时期大部分表达基因.通过初诊时及缓解期基因表达水平分析,推断个别基因除了可以通过获得性突变致病外,还可能通过差异表达在白血病发病中发挥作用.
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高通量测序技术在肺癌研究中的应用
近十年来,肺癌治疗从基于组织学特点选择化学治疗逐渐走向基于特定驱动基因实施个体化分子靶向治疗.高通量测序技术具有通量更高、运行时间更短、花费更少等优点.应用高通量全基因组深度测序技术从基因组水平揭示肺癌发生发展机制,寻找新的驱动基因作为靶向治疗靶点,发现并鉴定导致耐药的新序列变异,可从基因组序列水平阐明肺癌靶向治疗耐药机制.
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终板胆碱酯酶缺失型先天性肌无力综合征一家系的临床、电生理、肌肉病理和基因研究
目的 分析终板胆碱酯酶缺失型先天性肌无力综合征家系的临床、电生理、肌肉病理和基因特点.方法 先证者为15岁女性,出生即发现眼睑下垂、运动易疲劳、生长发育迟滞,病情缓慢进展,青少年期出现眼球活动受限、呼吸功能下降和脊柱侧弯.有一姐有类似表现,1岁时因肺部感染夭折.对先证者进行全面血液检测、电生理检查、肌肉病理和基因检测,并对父母进行家系验证.结果 先证者电生理检查可见运动神经传导单次刺激出现重复复合肌肉动作电位,重复神经电刺激可见低频递减、高频快速递减-轻度递增-递减-稳定现象.针极肌电图提示轻度肌源性损害.单纤维肌电图可见颤抖值增宽.肌肉活体组织检查符合轻度肌原性改变.基因检测发现COLQ基因c.1082delC、c.1190G ＞A复合杂合突变,分别来源于父母.结论 COLQ基因缺陷导致的终板胆碱酯酶缺失型先天性肌无力综合征具有特殊电生理改变,有助于识别.麻黄碱为首选治疗药物.
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1例宫内感染HIV-1婴儿的病毒准种变化特征研究
目的 通过比较母婴的Ⅰ型艾滋病病毒(HIV-1)的准种特征,了解病毒垂直传播的规律,并分析三联用药对婴儿体内病毒进化产生的影响.方法 收集1例HIV阳性母亲及其所生新生儿各时间点的血液样本,提取全血和血浆中的脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA),经聚合酶链反应(PCR)扩增出HIV-1编码核心蛋白(env)、包膜蛋白(gag)以及多聚酶(pol)的基因片段,进行定性定量、基因亚型和耐药分析;Hiseq高通量测序用来分析各样本准种分布和变化情况.结果 新生儿系列样本核酸检测结果均为阳性,母婴两者感染的HIV-1亚型为重组亚型(CRF08BC),均未检测到耐药突变株,且产时母婴血浆样本内病毒载量分别为68 700拷贝/mL和102 000拷贝/mL.所有样本经高通量测序后,母亲样本三区内的基因离散率都大于新生儿,但二者样本间的基因离散率均＜1.09％.三区系统进化树显示,新生儿体内的优势准种均来自母亲.新生儿产后样本中:前42天基因离散率稳定,三月龄时离散率开始升高,六月龄时离散率回落;样本内的基因离散率均＜0.85％,与基线样本间的基因离散率均＜0.81％.pol区系统进化树显示相对明显的进化关系.结论 母亲与新生儿感染的HIV-1病毒属当地流行亚型,两者有传播关系,新生儿感染了母亲全血样本内的多数优势准种.新生儿三月龄后病毒准种呈现波动性变化,说明抗病毒治疗能影响体内优势准种的分布,但由于样本时间间隔短,系统进化树分析准种进化的能力有限.
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婚内性传播的 HIV 准种传播和进化规律研究
目的 研究婚内性传播的艾滋病病毒(HIV)准种传播和进化规律,并探讨样本类型(全血、血浆)对分析结果的潜在影响.方法 选择传播关系和传播时间明确的4对婚内新近传播HIV夫妻作为研究对象,采集血液样本,分别提取全血、血浆中的总核酸、核糖核酸(RNA),进行HIV基因亚型分析.以HIV-1包膜蛋白(env)基因区为目的片段,分别将总核酸或RNA反转录产物进行巢式聚合酶链反应(PCR)扩增,构建脱氧核糖核酸(DNA)文库,Miseq高通量测序,分析HIV准种分布,计算样本内、夫妻样本间的基因离散率,并做系统进化树分析.结果 4对夫妻的HIV基因亚型分别相同.除1对夫妻的血浆样本PCR扩增失败外,其余14份全血、血浆样本成功进行Miseq测序,获得134 135(67 831～178 392)条有效序列,代表101(12～455)个独特准种.多数样本中前20个准种序列的频数占总序列数的比例＞80％;6/8的受检者全血样本中,第1个优势序列的频数占了90％以上;同一受检者全血样本中高频准种的分布比血浆中更集中.基因离散率、系统进化树分析结果显示,4对夫妻的婚内HIV传播关系都与预期相符,传播方向除1份血浆样本外同样与预期相符.结论 HIV准种的多样性和频数分布有助于了解HIV的传播和进化规律,全血样本所得的HIV感染溯源分析结果比血浆样本更可靠、更实用.
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福州地区88例听力障碍者致聋基因测序结果分析
目的：对福州地区非综合征聋患者相关基因突变分析，了解福州地区聋病患者常见突变基因及突变热点。方法收集福州地区88例非综合征聋患者外周血样本，对常见聋病基因GJB2、SLC26A4、12 S rRNA基因采用传统测序法分析进行检测，对未筛查出致病突变基因的样本采用高通量测序方法对其他聋病基因进行全面检测。结果共检测出聋病基因突变30例（34.09%），其中3个常见聋病基因突变占23例（26.14%），12 S rRNA突变14例，GJB2突变6例，SLC26A4突变3例；其他罕见基因MYO15A突变2例，MYO7A、OTOF、TECTA、TMC1、ILDR1各1例。结论福州地区非综合征聋患者中常见聋病基因突变率12 S rRNA高，其次为GJB2和SLC26A4，为福州地区聋病患者分子病因筛查及防治提供理论依据。
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先天性晶状体半脱位一家系FBN1基因突变研究及手术治疗
目的 对一个先天性晶状体半脱位家系进行FBN1基因突变筛查,总结该家系晶状体半脱位的治疗方法.设计 回顾性病例系列.研究对象 2014年5月就诊于北京同仁医院白内障中心一个先天性晶状体半脱位家系人员25例.方法提取该家系成员外周血全基因组DNA,利用目标基因捕获技术,收集目标基因组DNA,再利用HiSeq2000进行高通量测序,确定突变位点,用Sanger法验证测序结果.晶状体半脱位90°～180°者4例(8眼)行一期囊袋张力环IOL植入术(Phaco+ CTR+ IOL),二期晶状体囊袋复合体(IOL-CTR)单点巩膜缝合固定术.晶状体半脱位大于180°者1例(2眼)行晶状体玻璃体切除IOL植入,巩膜缝合固定术(PPL+ PPV+ IOL).2例(4眼)行晶状体囊内摘除术(ICCE),1例(1眼)行玻璃体切除术(PPV).主要指标 FBN1基因测序结果、术式、佳矫正视力(BCVA).结果该家系所有患者FBN1基因38号外显子mRNA第4588位碱基均出现C→T杂合性错义改变,导致患者均携带c.4588C＞ T(p.R1530C)突变体,而家系正常个体15人无此突变.行Phaco+ CTR+ IOL联合二期IOL-CTR术后BCVA 0.5～0.8.行PPL+ PPV+ IOL术后BCVA 0.3～0.5.结论 FBN1基因c.4588C＞ T(p.R1530C)突变体是导致该家系的致病原因.采用一期囊袋内张力环IOL植入及二期IOL-CTR单点巩膜缝合固定术矫正IOL偏位效果较好.
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胃癌患者口腔菌群的分布特征
目的 利用高通量测序,研究胃癌患者口腔微生物的菌群分布特征,获得口腔菌群及牙周致病菌与胃癌的相关性的科学证据.方法 采集胃癌患者和健康对照人群口腔中的唾液及牙菌斑样本,PCR扩增,并利用Illumina Miseq测序平台,对各样本中16S rRNA V4区进行双端测序通过BIPES以及QIIME分析并比较不同人群口腔中牙菌斑和唾液样本中细菌群落结构及其多样性,聚类分析胃癌患者口腔菌群失衡的主要特征.结果 胃癌患者和健康人群的口腔菌群的交叠情况结果显示胃癌患者的口腔细菌更为复杂,菌群的组成和相对丰度分析发现,在胃癌组的唾液和牙菌斑样本中某些细菌的异常聚集,包括:红环菌目(Rhodocyclales)、梭菌目(Clostridiales)、肠杆菌目(Enterobacteriales)、假单胞菌目(Pseudomonadales)、暖绳菌目(Caldilineales)、菌目Synergistales.而芽孢杆菌目(Bacillales)、Streptophyta和立克次体目(Rickettsiales)3个在胃癌组中异常减少.结论 胃癌患者的口腔微生物群落结构与健康对照人群有所不同,提示口腔菌群发生相应改变与胃癌有一定的相关性.表明口腔微生物的检测有潜力作为未来胃癌早期诊断或筛查的一种手段.
