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mRNA差异显示技术及在毒理学研究中的应用
RNA差异显示技术全称为mRNA差异显示反转录聚合酶链反应PCR技术(differentialdisplay reverse transcription polymerase chain reaction DDRT-PCR).该技术在分析基因表达差异、绘制遗传图谱、分离特异性表达基因和临床诊断遗传疾病等方面具有特殊的优势,因此一经建立就被广泛应用,并取得了可喜的成果.在毒理学研究中,不同的毒物或者不同剂量的同一毒物,诱发组织细胞及损伤后修复的病理生理过程在分子水平上表现为一些基因的开放、关闭或表达量的改变,阐明这些差异表达基因的结构与功能对研究毒物对机体的损伤机制及防治实践有重要意义.然而,在缺乏相关基础研究资料的情况下,要从细胞内上万种mRNA分子中鉴别出引起毒物损伤和损伤后修复的重要基因十分困难,而近10年出现的mRNA差异显示技术为研究毒物对机体的损伤及其损伤后的修复的机制提供了强有力的工具.现对其毒理学研究中的作用作一综述.
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大鼠矽肺相关基因组织蛋白酶B的电子克隆与验证
目的 探讨差异表达基因组织蛋白酶B在大鼠矽肺模型中的作用.方法 对以往经抑制消减杂交筛选得到的一条编号为ES110708的差异表达序列标签(EST)作为种子序列,通过电子克隆进行延伸,并在大鼠矽肺模型中用RT-PCR方法进行验证.结果 筛选得到的大鼠矽肺差异表达EST经电子克隆延伸得到了含有完整开放读码框架(ORF)的cDNA序列,长度为1977bp,比原来的EST片段(172bp)延伸了1805 bp.其ORF预测为1020bp,符合Kozak规则.将ORF序列进行同源性检索,其与序列号为NM022597.2的cDNA部分序列完全同源,说明所测ORF属于序列NM022597.2.该序列代表的基因是组织蛋白酶B.经RT-PCR验证,实验组大鼠肺组织Cathepsin B mRNA表达量明显上调.15 d、30 d、60d时,其吸光度(A)值分别为对照组的4.133、6.639、4.981倍,差异具有统计学意义(P＜0.05).结论 电子克隆能有效延伸EST序列直至全长cDNA序列,差异表达基因组织蛋白酶B可能参与了矽肺的发生与发展.
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差异表达基因筛选方法的比较
目的 比较基因芯片数据分析中常用的用于筛选差异表达基因的几种方法,探讨各方法的筛选效果.方法 使用Borferroni修正法等8种保守的方法以及两样本t检验、Wilcoxon非参数法、SAM共11种方法对模拟的芯片数据进行处理,以FDR(False discovery rate)和筛检的差异表达基因个数为指标考察其筛选效果.结果 SAM的FDR仅次于8种保守的方法,但筛检的差异表达基因个数较多,适合基因芯片初筛差异表达基因的目的.结论 SAM适合基因芯片初筛差异表达基因的目的.
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利用基因表达谱对组织样品分类方法的研究
目的探讨在基因表达谱数据分析中用主成分分析方法结合层次聚类法与K-均值聚类方法两种分类方法对组织样品分类的分类效果.方法用主成分分析方法对数据降维后进行聚类分析,与不经主成分分析直接聚类,并结合筛选与组织样品分型相关的基因的各种筛选水平,评价聚类效果.结果用约当指数进行评价两种聚类方法:经主成分分析后用提取的主成分聚类与不用主成分的直接聚类效果不同;不同筛选相关基因的筛选水平对聚类效果也有影响.结论对组织样品做聚类分析时,主成分分析能提高聚类质量,合理地筛选差异表达基因的方法能提高聚类效果.
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基因芯片数据的标准化及分析方法
随着人类基因组计划的发展,编码人类全部染色体的约3～4万条基因被发现,人类基因组计划由此进入后基因组时代,研究重点由发现基因转向探索基因的功能,由此产生了用于基因功能分析的新技术和新方法[1].基因芯片是生物芯片中发展成熟的一种高通量处理技术,它提供了从染色体水平分析基因表达模式的手段,而它所产生的大量数据对数据的分析和信息的提取提出新的挑战,如基因芯片数据的标准化,差异表达基因的鉴别,基因功能的分类,基因间的网络调控模式的分析等.
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湿热质人群差异表达基因的筛选及其功能研究
目的:该研究旨在探讨湿热体质是否存在表达量或种类相异于其他体质类型的基因,从微观水平了解湿热质的本质及其与疾病的关系.方法:根据王琦的9种中医体质分类及判定标准,在健康人群中收集湿热质人和平和质人各8例,空腹抽血,利用表达谱测序技术筛选出表达差异显著的湿热相关基因并初步分析其主要功能路径.结果:共筛选得湿热相关的显著性差异基因共27个,5条富集的信号通路.它们主要与免疫防御,自身免疫性疾病如T1DM、AITD、SLE,肿瘤,类固醇、叶酸代谢,编码结合蛋白与核小体结构蛋白,细胞外基质裂解等相关.结论:湿热质人群的基因表达特点主要体现在免疫防御机能较强,物质代谢紊乱等.因此它对某些自身免疫性及代谢性疾病可能存在患病倾向,也与炎症相关性疾病如肾病等的全程及预后存在较为密切的关系,因而对湿热偏颇体质及早调摄对于疾病预防显得极其重要.
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同卵双生子2型糖尿病患病差异性的基因表达谱比较
目的:分析同卵双生子间的差异表达基因,初步探讨双生子2型糖尿病(Type 2 Diabetes Mellitus,T2DM)罹患差异性的可能分子生物学特征.方法:根据双生子卵性相似诊断法,评判双生子的指纹、中指毛、耳垂、毛发等26项指标的相似度,判断双生子的卵性(同卵或异卵).应用基因芯片技术,以双生子的同胞弟弟为健康对照,筛选同卵双生子(Monozygotic Twins,MZT)之间的差异基因表达谱,并通过FatiGO数据库进行基因功能比较.结果:这对双生子为MZT.与健康对照比较,得到双生子的差异表达基因,大双为968个,小双为478个,二者之间相同的显著表达基因有15个,基因功能比较结果见免疫反应功能类基因及细胞因子通路显著表达.结论:同卵双生子T2DM患病的差异性主要与个体的免疫功能差异有关.
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骨关节炎肾阳虚证信号转导差异表达基因分析
目的:以基因芯片技术从差异基因表达角度分析骨关节炎肾阳虚证与信号转导相关差异表达基因.方法:先后筛选出符合西医膝骨关节炎和中医肾阳虚证诊断标准的患者两组,每组8例,与8例正常对照组比较.两组病人均取血、提取mRNA,经标记、杂交、清洗、芯片扫描、图像的采集与数据分析等过程,分别混合与对照组杂交作两张基因芯片,后对数据进行信息挖掘.结果:两张芯片各获得162和75条差异表达基因,其中与信号转导相关的分别为26条和11条;两张芯片共同差异表达基因6条,与信号相关的有3条,占总数的1/2.提示:信号转导是生命活动的一种基本和重要的方式.细胞间信号转导异常可能在肾阳虚证骨关节炎的发生、发展过程中起着重要作用.
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组织芯片联合基因芯片在肿瘤研究中的应用
组织芯片是指固定在载玻片上的组织微点阵,可同时进行分析大量同一实验指标(DNA、RNA及蛋白质)的研究;基因芯片是指固相载体上的高密度DNA微点阵,可检测异常组织与正常组织差异表达基因.组织芯片与基因芯片配合使用在寻找肿瘤基因中有很好的互补作用.利用基因芯片检测出差异表达的候选肿瘤基因,然后,利用组织芯片迅速筛选鉴定肿瘤基因.从而大大简化和加快从基础研究到临床应用的进程.
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mRNA差异显示研究进展
人类约有30000～35 000种不同的基因,在一定时间空间内约有2%的基因表达,基因表达的变化决定了细胞行为改变.分离并克隆差异表达基因不仅有助于揭示机体正常发育和异常病理变化过程,而且可直接应用于疾病诊断和临床治疗.目前,研究差异表达基因的方法有多种,但各处有其优缺点.本文仅就mRNA差异显示技术(differential display,DD)作一综述.
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应用基因芯片技术筛选长期机械应力刺激下表皮的相关基因研究
目的 探讨额部扩张皮肤表皮与颞部附加切口正常皮肤表皮基因的表达差异,在转录水平上探讨组织扩张分子生物学机制.方法 选取2009-2011年行额部扩张器的5例患者,收集患者额部扩张器张力大点 (扩张组)、颞部行附加切口处 (未扩张组)的全层皮肤5对,为了排除多种细胞和组织成分的干扰,将表皮与真皮分开,取表皮层进行全基因组表达芯片分析,筛选差异基因进行功能聚类分析,并对部分结果行荧光定量PCR验证芯片结果.结果 对5对数据分组分析,共筛选差异表达基因105个,上调93个,下调12个.筛选出的差异基因涉及氧化磷酸化、免疫、炎症、增殖、凋亡等多个生物学过程.选取8个差异基因行定量PCR,7个与芯片结果相符.结论 扩张皮肤的表皮与未扩张皮肤的表皮之间存在多处基因表达差异,可能从某些重要基因作为突破,为促进细胞增殖、加快扩张速度带来新的启示.
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应用基因芯片筛查差异表达基因在卵巢癌早期诊断研究中的作用
目前已有许多研究发现卵巢癌的发生、发展与许多已知和未知的基因有关.如果能明确卵巢癌基因表达谱变化,从分子水平上查明卵巢癌的发病机制,不仅有利于揭开其病因,也为早期诊断研究提供了基础.
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砷对小鼠小脑神经递质传递相关基因表达影响的基因芯片研究
[目的]应用基因芯片技术观察砷对小鼠小脑神经递质传递相关基因表达谱的影响,为探讨砷的神经毒性机制提供分子毒理学依据.[方法]昆明种小鼠30只,随机分为3组,即饮用水对照组、低剂量染砷组(1 mg/LAs2O3)和高剂量染砷组(4 mg/L As2O3),连续染毒60 d,断头法处死小鼠,利用基因芯片技术检测小脑组织神经递质的分泌、转运及膜受体相关基因表达谱的变化.[结果]基因芯片筛选结果显示,与对照组比较.染砷组小脑组织中差异表达2倍及以上的神经递质传递相关基因有17条.其中,表达下调的基因有10条,包括Tph2、Gria2、Grin1、Gabrb2、Camk4、Nrxn1、Lin7c、Nrxn3、syt1及Cpix2;表达上调的基因有7条,包括Slc6a2、Slc6a5、Slc6a11、SLc18a2、Sle18a3、Htr2c和Lin7b.[结论]慢性砷暴露可影响小鼠小脑神经递质传递相关基因的表达.
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哮喘患者气道上皮细胞关键基因的生物信息学分析
目的 通过比较支气管哮喘患者气道上皮细胞与正常气道上皮细胞的基因芯片数据,鉴定哮喘气道上皮细胞中的关键基因.方法对哮喘气道上皮细胞基因芯片数据GSE43696进行GE02R分析,筛选出差异表达基因.然后使用DAVID数据库对差异表达基因进行功能及通路富集化分析.利用STRING对差异表达基因进行蛋白相互作用网络图(PPI)分析,并选出关键基因及显著模块.结果共获得个差异表达基因,130个上调基因,225个下调基因,主要涉及细胞运动、生长因子结合离子转运和通道活性.共筛出9个关键基因,包括BDNF,ERBB2,IL6,VEGFA,KIT, ADCY4,PRKR2B,CCR6和NMU.结论筛选的关键基因均在支气管哮喘中起重要作用,为支气管哮喘的诊治提供潜在的治疗目标.
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子宫内膜异位症相关性不孕患者的子宫内膜差异表达基因cDNA文库的构建和筛选
目的:筛选子宫内膜异位症相关性不孕患者在着床窗口期子宫内膜差异表达基因,以了解子宫内膜容受性形成的分子基础.方法:采用抑制性消减杂交技术(SSH),建立人子宫内膜着床窗口期基因表达的消减文库,并通过测序和同源性比较确定差异表达的基因;用RT-PCR技术验证其中的翻译控制肿瘤蛋白(TCTP1)基因、载脂蛋白D(ApoD)基因、促红细胞生成素(EPO)基因在分泌期中期子宫内膜中的表达.结果:对消减文库中20个差异表达的克隆进行测序与同源性比较,筛选出8个在分泌期中期有差异表达的基因.其中TCTP1、ApoD、EPO基因在分泌期中期的表达水平有不同程度的升高,分别为1.35±0.12、1.24±0.10、1.05±0.23,分别与正常对照组的1.05±0.23、0.75±0.16、0.68±0.08比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论:应用SSH可有效地筛选出内异症相关性不孕患者着床窗口期子宫内膜差异表达基因,为进一步研究子宫内膜容受性形成的分子机理提供新的线索.
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胶原性关节炎大鼠滑膜基因表达谱研究
cDNA微阵列(又称基因芯片)技术是一种基因表达水平检测的高通量技术,根据遗传学中心法则,利用基因互补配对原理,在同一载体上同时进行多基因检测,能同时准确而且快速地获得成千上万个基因在mRNA水平的表达信息.类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一种以关节滑膜炎为主的自身免疫性疾病,致残率极高.滑膜类肿瘤样病变、软骨基质损害是其病理特点,认为是一种多因素参与,多基因改变协同作用的结果.为了获取更多基因表达信息,本研究采用含588个cDNA克隆的大鼠基因表达谱微阵列检测胶原性关节炎大鼠滑膜基因谱表达,并与正常大鼠进行比较.获取差异表达基因,为探讨类风湿关节炎病理机制提供线索.
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良恶性乳腺肿瘤外周血基因差异表达研究
目的：：利用基因表达谱数据，探讨良恶性乳腺肿瘤患者外周血基因表达变化。方法：从GEO数据库中获取良性和恶性乳腺肿瘤患者外周血单个核细胞(PBMCs)表达谱。 GEO2R在线工具筛选差异表达基因， DAVID工具富集基因功能和通路。 STRING数据库构建差异表达基因蛋白产物相互作用的网络，筛选核心基因。结果：良恶性乳腺肿瘤分别筛选到563和237个差异基因，乳腺癌差异基因涉及白细胞激活、血管生成等生物学过程以及白细胞跨内皮迁移信号通路。 IL8、RHOB、ITGB1等为关键基因。结论：良恶性乳腺肿瘤患者外周血基因表达模式存在明显差异，为将外周血作为替代材料应用于乳腺肿瘤的诊断及监测研究开辟了新思路。
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头颈部鳞状细胞癌相关基因的生物信息学分析
目的 从基因和分子水平探讨头颈部鳞状细胞癌(head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC)的发生机制.方法 从GEO数据库下载人HNSCC相关基因芯片数据,使用BRB-Array Tools软件筛选差异表达基因,采用DAVID、ToppGene、STRING、Cytoscape工具进行生物信息学分析.结果 BRB分析共筛选出263条差异表达基因,其中上调基因134个,下调基因共129个,对其进行生物信息学分析发现COL1A1、MMP9、COL1A2、COL3A1、MMP1等基因调节HNSCC细胞外基质受体相互作用、小细胞肺癌、肿瘤通路等,影响肿瘤的发生发展.结论 利用生物信息学分析能有效挖掘基因芯片内在数据,为进一步探讨HNSCC的发生机制提供理论参考.
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老年性痴呆患者颞叶皮层差异基因的生物信息学分析
目的：探讨老年性痴呆患者颞叶皮层的生物学网络调控机制及关键节点在痴呆早期的病机机制。方法从基因芯片公共数据库GEO中下载老年性痴呆患者颞叶皮层的基因芯片数据，采用在线分析软件STRING和PANTHER对表达明显差异的基因进行生物信息学调控网络分析，寻找关键节点基因。结果在40个差异表达基因编码的蛋白中，有19个蛋白与其他蛋白存在相互作用关系，TBP、AKT1、CS、HSPB1及PARD6A蛋白为调控网络的关键节点蛋白。差异明显的基因主要涉及分子结合、催化活性及转录调节活性功能，与阿尔茨海默病（ AD）-早老素信号通路、γ-氨基丁酸合成通路、AD-淀粉样蛋白分泌酶通路有关，参与了颞叶皮层的细胞间通讯、糖脂代谢、细胞转运等生理学过程。结论 AD颞叶皮层的发病与TBP、AKT1、CS、HSPB1及PARD6A等基因密切相关，主要涉及AD-早老素信号通路、γ-氨基丁酸合成通路和AD-淀粉样蛋白分泌酶通路，有利于针对性的采用具有调节相应网络功能的药物进行早期干预，保护AD患者的认知功能。
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缺血性脑卒中相关基因筛选和功能分析
目的 分析缺血性脑卒中基因芯片数据,筛选出与缺血性脑卒中发病密切相关的基因.方法 下载GEO数据库中有关缺血性脑卒中患者的数据,筛选出显著意义的差异表达基因,采用(DAVID)工具进行GO基因功能分析和(KEGG)通路富集分析,再应用STRING软件对差异表达基因构建蛋白-蛋白互作网络,使用Cytoscape软件分析和找寻与缺血性脑卒中发病相关的基因.结果 检索到GSE22255和GSE16561两个缺血性脑卒中的数据集,共有99个外周血标本.以P<0.05,差异倍数>1.0倍为条件筛选差异表达基因,共得到61个差异表达基因,其中表达上调58个,下调3个.GO功能注释显示这些差异表达基因主要参与炎症反应、免疫反应、中性粒细胞趋化生物过程;主要分子功能为化学因子活性、蛋白结合、细胞因子活性等;KEGG通路显示这些差异表达基因主要参与类风湿性关节炎通路、肿瘤坏死因子通路、Toll样受体通路.蛋白-蛋白互作网络和Cytoscape分析显示人类白细胞抗原(HLA)-DRB1、肽酰基精氨酸脱亚胺酶(PADI)4、IgG-Fc片段低亲和力受体(FCGR)3B、肿瘤坏死因子(TNF)、细胞因子信号抑制物(SOCS)3在缺血性脑卒中发病中与其他差异表达基因关联度高.结论 缺血性脑卒中发病过程中伴随着多个基因的差异表达,这些基因参与了多种细胞功能和信号通路,其中HLA-DRB1、PADI4、FCGR3B等与缺血性脑卒中的发病密切相关.
