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氡染毒大鼠气管-支气管上皮细胞的基因差异表达
氡(Radon)及其子体的致癌效应已引起广泛的关注,被国际癌症研究机构列入室内重要的致癌物质.Meta分析结果提示,氡暴露使矿工发生肺癌的危险性增高[1].本研究通过抑制性消减杂交(supprssion subtractive hybridization,SSH)方法,筛选氡染毒大鼠模型的气管-支气管上皮细胞差异表达基因,为探讨氡及其子体致肺癌的早期分子机制提供依据.
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Aβ1-40诱导大鼠脑皮质与海马差异表达基因的克隆与鉴定
我们于2001年3～8月以β-淀粉样蛋白1-40(beta-amyloid protein,Aβ1-40)注入脑室建立大鼠AD模型,采用抑制消减杂交(SSH)技术构建Aβ诱导大鼠皮质与海马差异表达的基因文库,旨在探讨Aβ1-40神经元毒性的分子机制.
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抑制性消减杂交筛选疾病相关基因的研究进展
随着人类基因组测序的完成,疾病相关基因的鉴定和克隆将会变得更加快捷和方便.一旦疾病基因的功能被揭示,将会对疾病发病机制产生新的认识.由于基因表达在疾病发展的不同阶段呈现出差异性,这就为我们寻找、鉴定和克隆致病基因提供了一个重要线索.抑制性消减杂交(SSH)就是近年来发展起来的一种有效的分离差异表达基因的方法.
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基因芯片筛选7例患儿哮喘基因的研究
目的 对7例支气管哮喘(简称哮喘)患儿的差异表达基因进行生物信息学分类.方法 实验组7例,对照组8例,抽取外周血并分离出淋巴细胞RNA,进行cDNA合成、标记及杂交,通过聚类分析来揭示标本之间可辨识的基因表达谱,后用GO分析和Pathway分析测定这些差异表达基因的作用.结果 在29 890个基因中,发现4 725个基因存在差异表达,其中1 660个表达上调,3 065个表达下调.GO分析发现这些基因在生物学过程、细胞组分及分子功能中存在不同的调节.Pathway 通路分析发现共有88条通路,其中基因表达上调通路有22条,下调有66条,进一步对这些通路的差异表达基因进行分析,发现有不少在3条以上的通路富集.结论 实验组基因表达与对照组相比存在很大差异,这些差异基因涉及多种生物学过程,表明小儿哮喘的发病是一个复杂的病理生理过程.
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基因表达谱芯片筛选瘢痕疙瘩差异表达基因
目的:瘢痕疙瘩是皮肤真皮伤愈合后遗留的高出周围皮肤、发红、坚硬的病理结构.患者不仅有瘙痒、刺痛等症状,关节部位瘢痕挛缩常限制肢体的功能活动,在面部等暴露部位还可导致毁容,从而严重影响患者的身心健康和受损部位的功能恢复,成为影响严重烧、创伤病人康复的一大难题.从分子水平了解瘢痕疙瘩发生机制,将为治疗这一病症提供可靠的线索,因此本课题探讨与瘢痕疙瘩发生相关基因群的表达变化,并对部分基因的功能进行初步分析.方法:按一步法抽提瘢痕疙瘩和正常皮肤组织的总RNA并纯化mRNA将8464条人类基因PCR产物按微阵矩排列点样于化学涂层的载玻片上,制成基因芯片.将等量的瘢痕疙瘩和正常皮肤的mRNA分别逆转录合成荧光分子(Cy5或Cy3)掺入的cDNA一链做探针,混合后与上述基因芯片杂交.经严格洗片后扫描芯片荧光信号图像,计算机分析后比较两种组织中差异表达的基因.通过RT-PCR技术和Northern杂交检测TGF-β1和c-myc基因在不同组织中的表达变化.结果:在8464种基因中,瘢痕疙瘩和患者自身正常皮肤组织间存在差异表达基因,在所测的3对临床标本中共有差异表达基因436条.根据这些基因表达蛋白的结构和功能,可以分为15类,如:癌基因和抑癌基因,运输蛋白基因,细胞信号和传导蛋白基因,细胞应急蛋白基因,与细胞骨架和运动相关的蛋白基因,细胞凋亡蛋白基因等,其中上调基因有282条(3.33%),包括TGFβ1和c-myc基因;下调基因有154条(1.82%).RT-PCR和Northern杂交方法证实,瘢痕疙瘩内TGFβ1和c-myc的mRNA含量都明显高于正常皮肤.结论:瘢痕疙瘩的发生是一个复杂的过程,多种基因表达的变化与其形成相关.微阵矩基因芯片在筛选瘢痕发生相关基因的改变时,具有快速、高通量和高敏感等特点,瘢痕疙瘩差异表达谱的分析为治疗瘢痕提供了新的思路和线索.
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膀胱移行细胞癌差异表达基因的克隆与鉴定
应用抑制消减杂交(SSH)构建膀胱移行细胞癌差异表达的消减文库,再应用Dot blot方法筛选出差异表达的基因,为研究膀胱癌发生、发展提供实验依据.现报告如下.
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应用基因芯片技术筛选胰腺癌多药耐药相关基因
目的 应用基因芯片技术筛选胰腺导管腺癌(PDAC)获得性多药耐药(MDR)相关基因.方法 通过含人类全基因组的寡聚核苷酸基因芯片(Affymetrix HG U133 2.0 plus)筛查人胰腺癌细胞株SW1990与多药耐药细胞亚株SW1990/5-FU,SW1990/ADM和SW1990/GEM之间的表达基因差异,并进行生物信息学分析.结果 与亲本株SW1990相比,3株耐药细胞亚株中表达均有差异的基因共有165条;其中上调表达基因43个,下调表达基因122个.差异表达基因的功能分类包括:抗氧化还原、细胞凋亡、细胞周期、信号转导、细胞黏附相关的基因等.聚类分析发现差异基因中的PRDX4簇、TNKS2簇及CCDC5簇可能与耐药发生密切相关.结论 胰腺癌对化疗的多药耐药是复杂的多基因作用的结果.本试验初步建立了胰腺癌多药耐药发生相关的总体基因表达改变图谱,为胰腺癌多药耐药发生机制的研究提供了新的靶点.
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不同分化胆管癌差异表达基因的分离、克隆和功能研究
从分子水平研究胆管癌发病机理及病理过程,对认识及防治胆管癌都具有重要的理论和实际意义.基于临床研究的结果[1],我们采用Liang 1992年建立的差异显示法(DDRT-PCR)[2],来寻找高、低分化胆管癌间差异表达基因的cDNA.1.材料和方法:(1)采用TRIzol总RNA提取试剂盒,分别提取高分化、低分化胆管癌新鲜组织总RNA,逆转录合成单链cDNA.(2)DDRT-PCR:在20 μL体系中对2 μL逆转录产物进行扩增,加入2 μmol/L 4dNTPs, 5 μmol/L 锚定引物T15M, 1 μmol/L随机引物, 37Bqα-32P-dCTP,1.5UTaq酶.(3)DD-PCR产物取6 μL上样于6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,恒定功率50W,电泳约3 h,滤纸揭胶,覆保鲜膜后压X光片,-70 ℃曝光14 h,显影.确定感兴趣的差异片段的位置并切胶,将切下的凝胶常规方法提纯并进行再扩增.(4)反向Northernblot鉴定:点样后,用化学变性及热变性法交联,标记探针基本上按照文献[3]进行.常规方法68℃杂交12 h,中等强度洗膜后放射自显影,-80 ℃压片22 h,显影.(5)PCR产物经纯化后可以直接用来测序,测序引物用T15N,PCR产物的核苷酸序列分析采用全自动DNA序列分析仪及配套的ABI试剂.
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青少年特发性脊柱侧弯椎间盘终板抑制消减cDNA文库的构建
用抑制消减杂交(SSH)构建组织间差异表达基因的cDNA消减文库,可进一步大批量筛选、克隆特发性脊柱侧弯表达的相关基因.
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宫颈癌介入治疗前后敏感相关基因的表达谱研究
目的 研究表达谱芯片筛选子宫颈癌介入治疗前后的差异表达基因,探究宫颈癌介入治疗的分子机制.方法 取3例治疗有效的宫颈癌治疗前后的组织标本,采用基因表达谱芯片筛查差异表达基因,利用MAS软件挖掘差异表达基因的功能通路.结果 介入治疗后和治疗前癌组织相比有209条基因表达上调,922条下降.功能分析示涉及细胞DNA修复、有丝分裂、BRCA1、BRCA2和ATR基因相关通路、乏氧相关因子等.结论 表达谱芯片可用来快速高通量筛查可能与介入化疗栓塞敏感性相关的差异表达基因.
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mdm2/p53通路相关的乳腺癌差异表达基因分析
目的 比较乳腺癌和正常乳腺组织的基因表达差异,探讨与mdm2/p53通路相关的差异表达基因.方法 提取11例乳腺癌和将5例正常乳腺组织等比例混合的组织总RNA进行芯片杂交,用SAM软件筛选差异表达基因,用GoMiner软件检索差异表达基因的功能,挑选参与细胞周期和凋亡的基因,通过Pathway分析方法检索与mdm2/p53通路相关的差异基因;用免疫组化方法验证差异基因cyclin A2及其相关基因CDK2在乳腺癌(38例)和正常乳腺组织(16例)中的表达.结果 乳腺癌与正常乳腺组织的差异表达基因共548个,其中参与细胞周期的基因有35个,参与凋亡的基因有23个;与mdm2/p53通路相关的差异基因有4个,分别是eyclin A2,cyclin B1,PCNA,YWHAZ;经免疫组化验证的38例乳腺癌和16例正常乳腺组织的cyclin A2表达阳性率分别为42.1%(16/38,和6.25%(1/16);CDK2表达阳性率分别为47.3%(18/38)和6.25%(1/16),两者均有统计学差异(P＜0.05);在乳腺癌中cyclin A2与CDK2的表达呈正相关,特别值得一提的是如果以≥2+ 为阳性在乳腺癌cyclin A2为26.3%,CDK2为31.5%,而在正常组几乎看不到≥2+的表达.结论 乳腺癌组织与正常乳腺组织相比存在着差异表达基因,与mdm2/p53通路相关的差异基因的异常高表达促进细胞增殖,与乳腺癌的发生密切相关,而cyclin A2和CDK2在乳腺癌共表达并明显高于正常组织其意义还不清楚.
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皮肤黑色素瘤芯片数据与生物信息学分析方法介绍
目的 皮肤黑色素瘤是一种恶性程度非常高的肿瘤,预后较差,早期易出现淋巴及血路转移.本研究通过对皮肤黑色素瘤和良性痣基因芯片进行数据挖掘及生物信息学分析,为两者鉴别诊断及探索黑色素瘤的发病机制及潜在药物靶点提供参考.方法 从基因表达综合数据库(gene expression omnibus,GEO)中选取45例皮肤黑色素瘤组织和18例良性痣组织的基因芯片进行生物信息学分析,筛选出差异基因,并采用DAVID(database for annotation,visualization and integrated discovery)和STRING(search tool for the retrival of interacting genes/proteins)数据库对差异基因进行基因功能、信号通路和蛋白互作分析.结果 共找到1 857个满足条件的差异基因,其中821个基因上调,上调差异表达基因主要涉及细胞增殖、有丝分裂、细胞周期和ECM-受体相互作用等;1 036个基因下调,下调差异表达基因主要涉及细胞黏附、炎症反应、免疫应答、氧化还原反应、PPAR和Rap1信号通路等,通过蛋白互作分析共选出10个关键基因GAPDH、AKT1、SRC、EGFR、CDK1、CAD、IGF1、PCNA、BIRC5和MMP-9.结论 GAPDH等关键基因可能促进了皮肤黑色素瘤的发生并参与了细胞增殖、黏附、炎症反应等生物学过程,后续依然有待于研究.除此之外,这些基因也为皮肤黑色素瘤鉴别诊断及探索黑色素瘤发病机制及药物靶点提供了参考.
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人胃癌腹膜高转移潜能细胞系的基因表达分析
目的:比较人胃癌细胞系与其腹膜高转移潜能细胞系的基因表达谱,寻找与胃癌腹膜转移相关的基因表达改变.方法:采用基因芯片技术,比较遗传背景相同但转移力有明显差异的两个细胞系GC9811和GC9811-P,分析其基因表达谱的差异.选取部分基因行RT-PCR进一步验证基因芯片的准确性.结果:在11 901个候选基因中,筛选出248个(2.1%)差异表达基因.GC9811-P与GC9811相比,表达上调的基因有218个,下调的有30个,包括DNA合成和错配修复基因如H3F3A、细胞增生基因、蛋白合成与修饰基因、信号传导基因和离子通道与运输蛋白相关基因等.半定量RT-PCR对PTEN、S100A4和ZNRD1基因检测结果验证了基因芯片数据的可靠性.结论:胃癌腹膜转移是多基因作用的综合结果,筛选的基因对预测胃癌腹膜转移和抗转移干预措施可能有指导意义.
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缺血性脑卒中患者恢复稳定期外周血单个核细胞中差异表达基因的生物信息学研究
目的 分析缺血性脑卒中(IS)患者恢复稳定期外周血单个核细胞(PBMCs)中的差异表达基因,为探讨脑卒中恢复稳定期的遗传病理机制提供生物信息学线索.方法选择GEO数据库中GDS4521芯片数据,该芯片以年龄、性别相匹配的20例IS恢复稳定期(脑卒中发生至少6个月以上)患者和20例未发生过脑卒中者作为研究对象,收集其PBMCs进行基因芯片检测,利用GEO2R、DAVID、g:profiler和String等工具,筛选和分析差异表达基因功能富集和相关信号通路情况.结果脑卒中恢复稳定期组与对照组相比,在PBMCs中发现37个基因表达明显变化,其中34个上升,3个下降.GO分析表明,这些差异表达基因在生物过程方面,以炎性反应、中性粒细胞趋化相关基因为多;在分子功能方面,以趋化因子活性相关基因为多.KEGG信号通路分析表明,位于TNF信号通路中的差异表达基因数量多.相互作用网络图揭示,这些差异基因主要以与炎性反应相关的两个网络为主.结论IS发生超过6个月后仍有多种功能蛋白和信号通路可能发生改变,特别是与炎性反应相关的蛋白和信号通路,提示炎性反应在IS的恢复稳定期仍可能对疾病的预后和再发起作用.
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脑胶质瘤中全长新基因PKIβ的克隆与表达
目前世界上在不同组织或不同病理样本中获取差异表达基因的方法有很多种[1-9].在各种技术中诸如:差异显示技术,只适用于少量样本,同时跑电泳的工作相当辛苦,并受限于一次电泳样品数量,而高密度的基因芯片,一次就能完成大量样本的基因表达水平上的筛选工作.
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单卵双胞胎银屑病患者外周血T细胞存在差异表达基因
目的 通过对单卵双胞胎外周血T细胞的研究,寻找与银屑病发病相关的差异表达基因,进一步探讨T细胞在银屑病发病中的机制.方法 采集两对同卵双胞胎[一对双胞胎同时患病(P1、P2),另一对双胞胎一个患病一个不患病(P3、N1)]外周血,分离并扩增T细胞,采用高通量RNA测序技术筛选差异表达基因,并对筛选的基因进行GO功能分析.结果 经过分析,共注释到9 449个基因,其中P1与P2相比较在表达上无差异的基因有5 438个,P3与N1相比较在表达上存在差异的基因有2432个；差异表达基因在同时患病双胞胎中占全部表达基因的57.55％,在不同时患病双胞胎中占全部表达基因的25.74％,表明不同时患病双胞胎基因表达差异率明显高于同时患病组；银屑病组与对照组相比较在表达上存在差异的基因有105个；且与特应性皮炎组比较在表达上存在差异的基因有40个,表达上调的基因有24个.结论 在外周血T细胞中,银屑病患者存在差异表达基因,可能与银屑病患者外周血T细胞活性异常有关.
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Mitf-m敲除小鼠的基因差异表达分析
目的 使用RNA-Seq技术分析Mitf-m敲除鼠与野生鼠的血管纹转录组,研究Mitf-m基因敲除后的差异表达基因及相关改变的分子机制.方法 分别取Mitf-m敲除鼠(Mitfm’△M/mi-△M;MM组)与野生鼠(Mitf-m+/+;WW组)的血管纹进行总RNA提取;制备cDNA文库,用Illumina HiSeq 2000测序系统行高通量测序.利用软件Tophat 2.2.0将clean reads比对到参考基因组;分别用软件RSeQS-2.3.2和cufflinks来检测测序结果的均一性和基因表达水平.使用edgeR和DESeq程序筛选差异表达基因(differential expressed genes,DEGs);选择下调DEGs,用KOBAS2.0进行基因本体(gene ontology,GO)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)代谢途径的富集分析.结果 MM组与WW组在参考基因组上mapping的clean reads数分别为42463888和3971 8542,分别有88.7％和87.4％的reads是唯一映射,说明RNA-Seq结果可靠.DEGs筛查结果表明,相对于WW组,Mitf-m敲除鼠血管纹有45个DEGs,上调表达基因有7个,下调表达基因有38个.GO富集分析发现下调表达基因与黑色素的合成和代谢过程、色素沉着有关,值得关注的是与内向整流钾离子通道Kcnj 10和Kcnj13相关.KEGG富集分析显示下调表达基因主要富集于黑色素生成通路.结论 RNA-Seq分析拓展了Mitf-m基因调控网,为探究Mitf-m突变所致听力-色素综合征的分子机制及特异性研究Mitf不同转录子的功能奠定了基础.
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牙根发育再生的控制中心:发育期根端复合体
牙齿的发育研究可以为牙齿再生及牙齿先天发育异常提供理论依据,同时牙齿发育也是发育生物学中器官发育形成的一个典型模型.目前牙齿早期发育研究较多,但后期的发育.特别是牙根发育相关基因研究较少.利用大鼠下颌磨牙和切牙具有完全不同的牙根发育模式作为动物模型,财牙根发育相关的差异表达基因进行筛选并对部分差异基因的功能进行探讨,为牙根发育及牙根再生研究提供理论依据.
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中子照射后小鼠骨髓差异表达基因的研究
目的 探讨中子照射后小鼠骨髓差异表达的基因及其意义.方法 二级雄性BALB/c小鼠60只,随机均分为对照组和照射组(n=30).照射组动物采用3.0Gy中子进行全身均匀照射,并分别于照射后6、24、72h活杀,每时间点10只;对照组在相应时间点各处死10只动物.应用HE染色方法观察照射后小鼠骨髓的病理变化.采用小鼠全基因组寡核苷酸芯片技术分析照射后6h小鼠骨髓差异表达的基因谱,并采用RT-PCR对部分结果进行验证.结果 3.0Gy中子照射后,小鼠骨髓腔内造血细胞进行性减少,并有大量出血,至照射后72h,骨髓腔内呈血池状,几乎见不到造血细胞.照射后6h,小鼠骨髓差异表达基因共390个,包括上调和下调基因各195个,功能涉及代谢、生长和发育、细胞信号通路、应激反应、增殖和死亡、免疫应答、细胞连接、物质运输、细胞周期以及功能未知基因等,其中可能与中子辐射损伤密切相关的基因功能涉及细胞周期调控(ccng1、ccne2)、细胞增殖与凋亡调控(bax、bbc3、traf5)、细胞因子合成(psg18、zbtb32、mknkl、cdld1、id4、t2bp)等.RT-PCR验证了部分基因(ccngl、bax、bbc3、ccne2、traf5)的表达情况,其结果与芯片检测结果一致.结论 中子照射后小鼠骨髓出现大量差异表达基因,其中ccng1、bax、bbc3、cene2、traf5和irf4可能为中子辐射致骨髓损伤的敏感靶基因.
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基于外周血细胞基因表达谱筛选检测胃癌的差异表达基因
目的 分析胃癌患者外周血细胞基因表达谱特征,筛选检测胃癌的差异表达基因.方法 对21名胃癌患者和21名健康对照者外周血样本进行RNA测序,利用生物信息学方法获取胃癌的基因表达谱特征.从胃癌的差异表达基因中筛选候选基因,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术在25名胃癌患者和48名健康对照者外周血样本中进行验证.使用受试者工作特征曲线(ROC)和Logistic回归分析评估差异表达基因筛查胃癌的潜力.结果 在胃癌患者与健康对照者外周血测序样本中检测到1258个差异表达基因(642个基因上调,616个基因下调).经过滤后选择差异显著的30个基因在新样本中进行qRT-PCR验证,其中3个基因(C1QB、MMP9和SMIM1)仍然具有差异性.Logistic回归分析显示3个基因联合鉴别胃癌的灵敏性为92％,特异性为72.92％,ROC曲线下面积为0.8708.结论 胃癌患者外周血细胞基因表达谱发生显著改变,并发现3个差异表达基因在新样本中仍然具有差异性.该研究为检测胃癌提供了一种有前途的非侵入性qRT-PCR方法.
