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猪胚胎中差异表达基因检测方法的研究
目的 探讨不同检测方法检测猪胚胎中差异表达基因的效果.方法 采用现行的ACPs differential display技术和改良的ACP方法检测人工授精和核移植猪胚胎中的差异表达基因.改良的ACP方法中第2次cDNA合成过程和DNA扩增过程在分开的步骤中执行.结果 采用现行的ACP方法无法获得真实扩增的DNA克隆,采用改良的ACP方法时获得了所愿的DNA克隆.结论 在检测猪胚胎差异表达基因中改良的ACP方法较现行的ACP方法更为有效.
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多发性硬化外周全血mRNA差异表达的来源及其特异性分析
目的 探究多发性硬化外周全血mRNA差异表达的来源及其特异性.方法 利用外周全血mRNA表达谱数据,分别筛选多发性硬化和炎症性疾病(感染性休克、肺结核)患者相对正常人群的差异表达基因并进行比较.筛选正常外周血中髓系相对淋巴系细胞的差异表达基因,并与多发性硬化患者相对正常人群的差异表达基因作比较.结果 比较多发性硬化患者与两种炎症性疾病(感染性休克、肺结核)患者相对正常人群的差异表达基因,发现交叠基因上/下调方向的一致性分别为91.32%(P<0.05),93.23%(P<0.05).比较多发性硬化患者相对正常人群的差异表达基因及正常人群髓系相对淋巴系细胞的差异表达基因,发现交叠基因上/下调方向的一致性为96.82%(P<0.05).结论 多发性硬化患者相对于正常人群的差异表达基因与炎症性疾病患者相对正常人群的差异表达基因高度一致,同时与髓系相对淋巴系细胞的差异表达基因同样高度一致.上述结果表明多发性硬化患者外周全血中观察到的基因表达的改变可能是由于髓系/淋巴系细胞构成比例改变所致,是非特异的炎症性改变.
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一种简单快速克隆IL-6信号转导相关基因的方法
细胞因子作用于受体时的一个重要结果是诱导基因表达.为了克隆与IL-6诱导相关的基因,我们利用一个快速的改良DD-PCR方法,分离并检测了IL-6诱导和未诱导的U937细胞的差异表达基因.用三个完全变性的6-mer引物进行反转录,用2或3个较长的随机引物进行PCR扩增,扩增产物很在2%琼脂糖凝胶电泳上分离,之后回收差异片段并直接用于克隆和测序.在研究中,获得了7个不同的EST,序列分析表明其中2个EST可能是与细胞信号转导相关的新基因片段;反向Northern杂交证实它们是与IL-6作用相关的差异表达基因.
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利用表达谱基因芯片筛选溃疡性结肠炎差异表达基因
目的:利用人类全基因组表达谱芯片技术,分析溃疡性结肠炎患者和健康者基因表达谱差异,筛选出溃疡性结肠炎相关基因.方法:采用Trizol法提取8例溃疡性结肠炎患者和8例健康对照者结肠粘膜组织总RNA并纯化,逆转录合成cDNA,利用荧光染料Cy3标记aaUTP,转录合成标记的cRNA,并与Agilent人类全基因组表达谱芯片杂交,扫描荧光信号图像,对芯片原始数据进行归一化处理,利用倍数差异和t检验计算筛选出相关差异表达基因,采用DAVID在线分析系统进行基因的功能注释和关联分析,明确差异基因的生物学功能,并对部分差异表达基因进行实时荧光定量PCR验证.结果:筛查出溃疡性结肠炎结肠粘膜组织差异表达基因4132个,其中上调基因2004个,下调基因2128个.选取6条差异表达基因进行PCR验证,结果有3条基因表达上调,3条基因表达下调,表达趋势与芯片结果一致.结论:溃疡性结肠炎患者与健康对照者基因表达存在明显差异,分析这些差异表达基因有助于我们探索溃疡性结肠炎的发病机制,为疾病的治疗提供理论依据.
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表观基因组研究揭示23个由 DNA 甲基化异常介导的乳腺癌致病基因的研究
目的：筛选并系统分析由DNA甲基化介导的乳腺癌致病基因。方法本研究利用国际癌症基因组计划提供的表观基因组数据，通过生物信息学方法筛选并系统分析了乳腺癌中异常表达的基因及其表观遗传调控机制。结果通过t检验筛选了428个乳腺癌异常表达的基因，功能富集分析揭示乳腺癌中上调的基因与细胞周期密切相关，而下调的基因则显著富集在激素反应相关的功能上。对DNA甲基化组的研究揭示乳腺癌呈现了独特的DNA甲基化模式，并筛选到23个由DNA甲基化异常介导的乳腺癌致病基因。结论 DNA甲基化可介导乳腺癌致病基因的异常表达，是乳腺癌早期诊断和预后的重要生物标记。
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斑蝥素酸镁对人肝癌细胞株SMMC-7721转录组的影响
目的 通过RNA-seq分析斑蝥素酸镁对肝癌细胞转录组的影响,为阐明斑蝥素酸镁对肝癌细胞增殖的抑制效应提供分子信息,以期为临床上利用斑蝥素酸镁治疗肝癌提供相关理论基础.方法 体外培养的肝癌细胞株SMMC-7721,用不同浓度(0、0.895、1.790、2.685 μmol/L)的斑蝥素酸镁干预48 h后,利用MTT检测细胞抑制率;采用illumina Hiseq2500测序平台对1.790μmol/L处理组和对照组(0μmol/L)进行RNA-seq分析;根据RNA-seq结果,利用qRT-PCR检测了磷脂酰肌醇-3-羟激酶(PI3K)、蛋白激酶B(Akt)、细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)等基因的表达水平.结果 不同浓度(0.895、1.790、2.685 μmol/L)的斑蝥素酸镁干预48 h后,与对照组(0μmol/L)比较,均能显著抑制SMMC-7721细胞增殖(t=33.48、90.30、151.01,P＜0.01).通过RNA-seq分析,斑蝥素酸镁干预后,共导致150个基因表达发生显著变化,82个基因显著下调(P＜0.01),68个基因显著上调(P＜0.01),这些差异基因涉及Ribosome、Hippo signaling pathway、MAPK signaling pathway、PI3K signaling pathway、mTOR signaling path-way等通路,影响肝癌细胞的增殖、代谢及凋亡;通过qRT-PCR检测,1.790 μmol/L斑蝥素酸镁能够显著降低PI3K、Akt及ERK1/2的转录水平,抑制细胞增殖.结论 通过RNA-seq检测及分析,PI3K、AKT和ERK信号通路的抑制可能在斑蝥素酸镁抑制肝癌细胞增殖中发挥作用.
关键词： 斑蝥素酸镁 肝癌细胞SMMC-7721 转录组 差异表达基因 RNA-seq -
右归丸对肾阳虚证患者干预效应的差异表达基因功能网络分析
目的 探讨右归丸治疗肾阳虚证网络化分子调节机制.方法 根据肾阳虚证评定量表,选取肾阳虚证患者18名给予右归丸治疗一月,选择疗效好的8例作治疗前后的基因芯片杂交测试,采用SAM软件筛选显著表达基因并予以基因本体功能注释,采用BiosoGenet工具构建基因功能网络.结果 右归丸治疗肾阳虚证的总有效率为87.5％.当假阳性率为5％时获得25个显著表达基因,其中14个基因获得基因本体注释,在分子功能、生物学过程及细胞成分3个方面,分别得到12、14及7个显著性基因本体类.基因功能网络结构可以分为三个模块,模块1(UBC基因群)和模块3(DD1T3基因群)基因功能比较广泛,而模块2(MS4A1基因群)主要为免疫反应功能相关基因.结论 本研究从基因功能网络角度,提示调节机体的免疫功能为右归丸治疗肾阳虚证的重要疗效机理之一.
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抑制差减杂交技术在细菌基因差异表达研究中的应用
同种细菌基因组差异及基因差异表达的鉴定与研究具有重要的分子生物学意义。某一菌株所具有的而另一菌株所缺乏的基因可能决定菌株重要的遗传特征。抑制差减杂交技术是近年来新建立起来的一种快速鉴别差异表达基因的新方法，本文就该方法的原理及在原核细菌中的应用作一综述。
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基于RNA测序研究过表达AJUBA对T47D基因表达谱的影响
目的 探究AJUBA基因对于雌激素受体阳性乳腺癌细胞T47D基因表达的影响.方法 构建AJUBA 稳定过表达的T47D细胞系.载体对照组和实验组分别提取RNA进行转录组测序技术(RNA-seq)测序,将所得序列映射到人类基因组并进行转录组重建,样本标准化后寻找实验组和对照组之间的差异基因,利用生物信息学方法进一步对所得的差异基因进行基因本体论(GO)分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集性分析,同时挑选部分基因用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)进行基因表达验证.结果 实验组与对照组细胞相比共找到568个差异基因,其中上调基因239个,下调基因329个.GO分析中,注释到分子功能、生物学过程和细胞组成的上调差异基因分别有3、23、8个;下调差异基因分别有21、35、9个.KEGG分析中上调基因显著富集通路有2个,下调基因显著富集通路有4个.结论 AJUBA过表达可以影响T47D细胞的一系列生物学过程相关的多条信号通路,可能在乳腺癌发生、发展中起重要作用.
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中华按蚊热激蛋白40(HSP40)cDNA序列的全长扩增
目的 为获取中华按蚊感染约氏疟原虫后24 h的高表达基因热激蛋白40(HSP40)cDNA的全长序列. 方法 运用抑制性消减杂交技术(suppression substractive hybridization,SSH)构建中华按蚊感染约氏疟原虫后24 h的差异表达基因文库,从高表达文库中获得长度为363 bp的HSP40基因的cDNA片段,运用RACE技术对其cDNA序列进行全长扩增. 结果 获得中华按蚊HSP40 cDNA的全长序列,总长度为1 159 bp,开放阅读框为1 014 bp,编码337个氨基酸. 结论 获得了中华按蚊HSP40 cDNA的全长序列.
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RNA测序研究筛选血管紧张素Ⅱ诱导的心脏重构候选基因
目的 研究血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的心脏重构的机制和筛选潜在治疗靶点.方法 大鼠心脏成纤维细胞(CFSs)加入10 nM AngⅡ后培养12h,对照组未加入AngⅡ.从2组样品中提取RNA后,检测细胞基因表达水平.使用R语言中的limma软件包筛选两组样本间的差异表达基因(DEGs),并通过富集分析探讨它们的功能和参与的信号通路.此外,通过蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络构建揭示它们在蛋白水平的关系.结果 共筛选了126个上调基因和140个下调差异表达基因.根据富集分析发现:其中的ACACB,IL1B,IL1A,NOS2和MMP3与免疫反应、血管生成的调控、超氧代谢过程和羧酸结合生物过程高度相关.PPI网络构建显示:ACACB和MPP3是两个主要节点.结论 ACACB,IL1B,IL1A,NOS2和MMP3这五种基因,可能是AngⅡ诱导心脏重构的重要候选标志物.
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结直肠癌相关差异表达基因的生物信息学分析
背景:结直肠癌(CRC)是消化系统常见肿瘤,发病率和死亡率较高.目的:应用生物信息学方法对CRC差异表达基因进行分析,筛选与CRC发生、发展相关的基因.方法:从公共基因表达数据库(GEO)下载CRC基因芯片GSE32323、GSE21510、GSE9348数据集,使用R语言筛选差异表达基因.在DAVID数据库中对差异表达基因行GO和KEGG分析.应用STRING、Cytoscape构建蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络,筛选出CRC的核心基因.结果:在三个数据集中共筛选出834个CRC共同差异表达基因,包括376个上调基因和456个下调基因.GO分析表明差异表达基因主要参与细胞分裂、增殖、代谢等过程.KEGG分析显示差异表达基因主要富集于p53通路和细胞外基质蛋白通路.PPI网络共筛选出20个核心基因.结论:运用生物信息学方法对CRC基因芯片进行分析可为CRC发病机制、肿瘤标记物的筛选和治疗药物靶点的选择提供理论基础.
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蚊媒感染疟原虫后应答性表达增高基因的富集和筛选
目的分离和识别蚊媒疟原虫感染相关基因并探讨其机制.方法以斯氏按蚊-约氏疟原虫为实验模型,分别将刺叮约氏疟原虫感染鼠血和正常鼠血后24 h的饱血斯氏按蚊作为T组和D组,经抑制性差减杂交和选择性PCR扩增,建立一个T组表达特异增高基因的差减cDNA库.将此差减库分别与T组和D组的cDNAs混合探针作斑点杂交,筛选出差异表达基因,测定其序列并做基因库BLAST搜索.结果T组相对于D组的差异表达基因得到有效富集,58个重组克隆中有24个表达增高,阳性率为41.4%.所代表的23个基因搜索结果显示,12个与功能已知的基因同源,4个与功能未知的基因同源,7个为新发现的基因;其中9个与LPS诱导的冈比亚按蚊免疫反应性细胞系EST同源,占39.1%(9/23).结论建立了蚊媒感染疟原虫早期(24 h)直接导致的全基因组应答性表达增高cDNA库,筛选结果显示蚊虫对疟原虫感染的反应涉及多种生化途径及机制,尤其与天然免疫系统和能量代谢关系密切.
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应用抑制消减杂交技术筛选大肠癌相关基因
大肠癌是我国常见的消化道恶性肿瘤,其死亡率也呈增长趋势.研究显示,大肠癌发生过程是一个多步骤、多因素、涉及到多种基因及产物的相互作用.但至今尚未发现与大肠癌发生发展有关的特异性基因.本课题利用抑制消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)构建大肠癌与癌旁组织的消减cDNA文库,系统分离差异表达基因,并分析这些基因的功能,以期筛选到新大肠癌相关基因,为进一步明确大肠癌发生发展的分子基础及临床大肠癌的诊治提供研究基础.
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胃癌及癌旁组织基因表达分析
为了解胃癌特异基因表达谱,寻找在胃癌及癌旁组织中的差异表达基因,我们采用微阵列(microarray)技术分析588种已知基因在胃癌中的表达概况,为终揭示胃癌的分子遗传学变化,阐明胃癌的发病机制,为胃癌的早期诊断和治疗提供线索.
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表达谱基因芯片筛选巨指脂肪组织差异表达基因
目的 利用表达谱基因芯片初步研究巨指脂肪组织mRNA表达谱差异性,并筛选验证差异基因,为后续研究提供基础数据.方法 自2012年4月至12月,我们共收集5例巨指症患儿正常和病变脂肪组织.提取组织RNA后,检测总RNA的质量和纯度,合格样品RNA反转录制备含荧光分子Cy5标记的cDNA探针,与含有30968点cDNA的表达谱芯片杂交后扫描荧光强度,筛选出差异表达的基因并进行分析,选取5个基因利用实时定量PCR技术验证差异表达.结果 使用mRNA表达谱芯片筛选出了1725个差异表达基因,其中上调基因801个,下调基因924个.实时定量PCR结果显示4个基因表达上调,1个基因表达下调,表达趋势与芯片结果一致.结论 巨指症患儿中受累脂肪组织和正常脂肪组织基因表达存在差异,分析这些表达基因有助于我们探索巨指发病机制,为疾病治疗提供理论依据.
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基因芯片对骨肉瘤发病相关基因的筛查
目的: 筛查骨肉瘤发病相关的基因,探讨其对于骨肉瘤发病的意义.方法: 采用3个骨肉瘤细胞株(MG-63、Saos-2、U-2OS)及1个成骨细胞株(Hfob1.19),提取总RNA ,合成生物素标记的cRNA,与Affymetrix(R) GeneChip(R) U133A芯片杂交,筛查骨肉瘤细胞差异表达≥2.0倍的基因.挑选其中10个差异表达基因,分别设计合成引物,用嵌合荧光(SYBR(R) Green Ⅰ)实时PCR法定量检测9 例新鲜骨肉瘤标本中该10个基因的表达水平,应用ABI Prism 7 000分析其与成骨细胞株之间的表达差异.结果: 在芯片包含的所有基因(约22 000个转录本)中,3个骨肉瘤细胞株与成骨细胞株相比较,共同上调58个基因,共同下调142个基因;这些差异表达基因主要包括能量和物质代谢基因、癌基因、信号转导基因、转录相关基因、细胞周期基因、细胞凋亡基因、免疫反应基因、抑癌基因等.在200个差异表达基因中挑选10个差异表达基因,利用实时RT-PCR检测9例骨肉瘤组织标本中该10种基因的表达结果与芯片结果完全相符.结论: 骨肉瘤是一种多基因病变,应用基因芯片可以发现该肿瘤发病相关的基因,为深入探讨骨肉瘤的基因机制奠定基础.
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cDNA基因芯片对人胶质瘤组织原发性耐药相关基因的筛查
目的:利用cDNA基因芯片筛查与人脑胶质瘤原发性耐药相关的基因,为获取不同个体胶质瘤化疗药物药敏预报基因提供实验依据.方法:收集符合要求的临床手术切除的人脑胶质瘤组织标本共6例,原代培养肿瘤细胞;由MTT法检测替尼泊苷(teniposide ,VM-26)对胶质瘤细胞生长的抑制率,按VM-26 45 μg/ml(人血药峰浓度)时抑制率>30%为敏感、≤30%为耐药作为标准,将6例组织细胞分为耐药和敏感2组.cDNA芯片检测结合聚类分析方法筛查瘤细胞中与耐药相关的差异表达基因;以半定量RT-PCR法检测瘤细胞中HDAC1基因表达加以验证.结果:根据VM-26对细胞抑制率将6例胶质瘤细胞分为3例VM-26敏感和3例耐药.cDNA芯片结合聚类分析共筛选出有表达差异的基因21个,其中表达上调的基因6个、表达下调的基因15个.将表达差异明显的HDAC1经半定量RT-PCR验证,该基因在6例组织中都有表达,趋势与芯片结果一致.结论:胶质瘤原发性耐药可能与cDNA芯片筛查到的21个基因相关,其确切的耐药机制需要进一步深入研究.
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大鼠脊髓损伤修复差异表达cDNA文库的构建
目的运用改良消减杂交技术构建大鼠脊髓损伤修复过程中出现的差异表达基因文库,为寻找在脊髓损伤后的修复过程中起关键作用的分子提供帮助.方法在经典消减杂交的基础上引进SMART反转录、长距离PCR、磁性分离系统、离心柱色谱等方法建立改良消减杂交技术,通过两轮消减杂交构建差异表达基因的cDNA消减文库,并对文库中的差异基因进行批量克隆与生物信息学分析.结果将两轮消减杂交后的差异表达基因转化大肠杆菌JM109以建立差异表达基因文库,库容量大小为2×103.从文库中随机挑取90个克隆进行酶切鉴定与测序分析,得到40个差异基因序列,其中32个已知序列,8个新序列.结论通过改良消减杂交成功建立了脊髓损伤修复过程中出现的差异表达基因文库,为筛选在大鼠脊髓损伤修复过程中起关键作用的基因,进一步探讨脊髓损伤修复的分子机制奠定了基础.
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应用基因芯片筛查鼻息肉相关差异表达基因
目的 应用基因表达谱芯片筛查鼻息肉相关差异表达基因.方法采用含有人类全长基因的寡聚核苷酸芯片检测6例鼻息肉组织、6例正常鼻黏膜组织的相关差异表达基因,选择部分差异表达基因进行RT-PCR验证.结果筛查出鼻息肉组织差异表达基因共1 886条,共同差异表达基因18条,上调基因12条,下调基因6条,包括编码横跨膜4超家族蛋白、IFN-γ诱导蛋白IP-30前体、补体因子前体、胰岛素生长因子结合蛋白、IL-8、RGS1、GRRK4、CCL20、子宫球蛋白等基因.RT-PCR测定差异表达基因IL-8、RGS1与基因芯片检测结果一致.结论鼻息肉基因表达谱存在差异,RGS1通过影响细胞信号传导通路发挥作用,IL-8促使炎性细胞释放多种炎性递质参与鼻息肉发病,IFN-γ诱导蛋白和胰岛素生长因子结合蛋白等基因在鼻息肉发病中起重要作用.
