抑制消减杂交(SSH)技术及在克隆基因方面的新进展

基因表达的变化是调控细胞生命活动的核心机制,分离并克隆差异表达基因已成为现代分子生物学研究的热点,亦是功能基因组学研究的重要内容之一.抑制消减杂交技术以其低假阳性率、高灵敏度等优点,被广泛应用于生物及医学领域中差异表达基因的克隆.

胶质母细胞瘤相关基因的筛选和生物信息学分析

目的 使用生物信息学的方法寻找胶质母细胞瘤(glioblastoma,GBM)的致病基因并为后续深入研究其治疗提供潜在靶点.方法 从GEO数据库中下载基因芯片数据GSE104267,同时利用数据库自带的GEO2R在线分析工具筛选出正常组织与GBM的差异表达基因.然后运用Funrich软件和Cytoscape中ClueGO插件分别对差异表达基因进行GO分析和Reactome通路富集分析,接着再使用STRING和Cytoscape软件来构建蛋白相互作用网络,后使用cytoHubba插件提取互作网络中的关键基因.结果 筛选出653个差异表达基因,其中上调的基因222个,下调的基因431个.GO分析表明差异表达基因主要细胞通讯、信号转导以及免疫应答等生物学过程.Reactome通路分析表明差异表达基因主要与免疫系统、 白介素-10以及γ-干扰素等密切相关.RAC2、PTPRC、ITGB2、CCL2、TLR2为筛选出来的关键基因.结论 运用生物信息学筛选出GBM中的差异表达基因,其中数个基因已被报道参与GBM的病理过程,剩余基因虽有报道可影响多种肿瘤的发生发展进程,但尚未在GBM中报道,提示其可能是治疗GBM的新靶点.

乳腺癌基因芯片实验数据分析与挖掘

目的 对公共数据库上下载得到的乳腺癌基因芯片试验结果进行数据分析,找出在正常组织与癌组织中呈现差异表达的基因,并寻找差异表达基因的相关基因.方法 综合运用显著性分析(SAM)、顶级评分基因对(TSP)、关联规则挖掘等方法,对数据进行处理.结果 筛选出若干呈现差异表达的基因,并且寻找了其中一部分基因的可能高度相关的基因.结论 筛选出的基因及其相关基因可用于为进一步的研究提供候选基因.

应用基因芯片筛选前列腺癌差异表达基因的研究

目的 筛选前列腺癌发生发展过程中的差异表达基因,构建差异调控网络.方法 从基因表达数据库(GEO)中下载编号为GSE3325的基因芯片(13例正常、原发性前列腺癌和转移性前列腺癌的独立样本与6例三者的混合样本),筛选前列腺癌和正常前列腺组织的差异基因(P＜0.05及差异值＞2或＜-2)；计算差异基因与靶基因间的皮尔森相关系数(| PCC |＞0.75),构建差异调控网络；基因本体论(GO)富集方法分析差异调控网络基因的功能.结果 原发性前列腺癌与正常前列腺组织筛选到5847个差异表达基因,转移性前列腺癌与正常前列腺组织筛选到2026个差异基因,原发性前列腺癌与转移性前列腺癌筛选到977个共同的差异基因；原癌基因同源体( MYC)、E2F转录因子1(E2F1)、肿瘤蛋白53( TP53)和雌激素受体1(ESR1)基因在差异调控网络中起核心作用.结论 筛选出前列腺癌的差异表达基因.

筛选瘢痕疙瘩差异表达基因表达谱芯片的构建

我们通过构建以8 400条人类基因的多聚酶链反应(PCR)产物为靶基因的基因微阵列芯片,筛选瘢痕疙瘩和正常皮肤中差异表达的基因,探讨这些基因与瘢痕疙瘩生物学特性的内在联系.

肺腺癌及其脑转移肿瘤组织的转录组测序研究

目的 分析肺腺癌原发病灶、癌旁组织、癌症脑转移病灶的基因表达.方法 收集1例患者肺腺癌原发病灶、癌旁组织、癌症脑转移病灶的组织样本进行测序,DEGseq算法筛选出差异表达基因.结果 与癌旁组织比较,原发病灶中存在着845个基因表达失调(9个上调,836个下调,P＜0.01);癌症脑转移病灶中存在着813个基因表达失调(229个上调,584个下调,P＜0.01);与肺腺癌原发病灶比较,癌症脑转移病灶中存在着218个基因表达失调(130个上调,88个下调,P＜0.01).结论 转录组测序可以同步、全面的获取组织样本中的基因表达信息;随着肺腺癌病灶发生脑部转移,差异基因呈表达上调的趋势.

表观遗传学改变与胶质瘤发生的分子关系

我们对人脑胶质瘤分子病因研究看好于从基因芯片入手,分析其发生发展过程中的差异表达基因[1],再通过分子生物学手段认定目标基因后作进一步研究,其基本原理是目标基因所在的染色体结构发生了变化.然而,新近崛起的表观遗传学认为,胶质瘤的发生发展也可能与其表观遗传学改变有关,而这种改变有可能发生在染色体结构改变之前的诸如相关DNA甲基化异常等等.这是从另外一个视角观察胶质瘤发生分子病因的新动向,值得我们关注.

基因芯片筛选多形性胶质母细胞瘤差异表达基因和通路

目的 利用基因芯片技术和生物信息学分析方法,筛选出多形性胶质母细胞瘤相关的核心基因和信号通路,为寻找多形性胶质母细胞瘤早期诊断和靶向治疗潜在标志物提供依据.方法 从GEO数据库中获取多形性胶质母细胞瘤mRNA表达谱芯片原始数据,利用R软件分析得到明显差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs),对DEGs进行功能注释(GO ontology)和KEGG信号通路(KEGG signaling pathway)富集,进一步构建蛋白质相互作用网络(protein-protein interaction network,PPI),筛选核心基因,后利用TCGA肿瘤数据库进行验证.结果 通过Pearson聚类分析发现肿瘤和正常组织聚类区分明显,说明表达谱结果可靠;差异基因共2 142个,其中上调基因968个,下调基因1 174个;GO和KEGG富集结果显示,差异基因的功能主要涉及细胞周期、细胞分裂和增殖、突触传递等生物学功能和通路,通路网络分析表明MAPK信号通路起核心调控地位.通过构建PPI网络筛选出9个与GBM密切相关的核心基因,进一步利用TCGA肿瘤数据库验证,与芯片结果一致.结论 KEGG信号通路和核心基因可能揭示了多形性胶质母细胞瘤发生发展的分子机制,核心基因可能用作多形性胶质母细胞瘤的早期诊断的分子标志物和治疗靶点.

哈萨克族食管癌差异表达基因的研究

目的筛选并克隆在哈萨克族食管鳞癌与正常食管组织之间差异表达的基因.方法 (1)应用抑制性消减杂交(SSH)进行基因差异表达分析,构建哈族食管鳞癌组织和正常食管黏膜组织之间差异表达的cDNA消减文库;(2)克隆、鉴定食管癌组织特异表达的基因;(3)登录Genbank,运用Blastn程序进行同源性分析.结果成功构建了消减效率高的哈族食管鳞癌cDNA消减文库,对其中6个克隆的插入cDNA片断进行测序,经检索Genbank表明:这些差异表达基因与跨膜受体、乳腺癌转录因子、蛋白剪接基因及染色体1、8不同区域有较高的同源性.结论通过抑制性消减杂交技术构建了哈族食管鳞癌cDNA消减文库,并分析鉴定了部分差异表达基因,为进一步筛选鉴定食管鳞癌特异性基因及其全长克隆、功能研究等提供了依据.

Hoehn-Yahr分级为1期的帕金森病患者外周血基因差异表达分析

目的:对Hoehn-Yahr分级为1期的帕金森病(PD)患者外周血进行基因芯片研究,分析PD患者外周血基因表达的变化.方法:从GEO数据库中获得Hoehn-Yahr分级为1期的PD患者外周血基因数据集GSE54536.运用GEO2R筛选差异表达基因,DAVID工具进行富集基因功能和通路分析.STRING数据库构建差异表达基因蛋白相互作用的网络,应用CytoScape软件筛选核心基因.结果:共筛选到997个差异基因,涉及细胞间信号转导、细胞分泌等生物学过程及PI3K-Akt等信号通路.c-fos、KDM6B、ESR1等为核心基因.结论:通过对Hoehn-Yahr分级为1期的PD患者外周血的基因芯片进行研究,提示PD为多种基因,多种分子机制相互作用的结果,对相关分子机制的研究有助于进一步阐明PD患者的发病机制.

口腔扁平苔藓发病相关基因cDNA消减文库的建立

目的:建立口腔扁平苔藓差异表达基因的cDNA文库.方法:采用改良消减杂交技术,以口腔扁平苔藓病变组织总mRNA为实验组, 采用改良的SMART PCR cDNA 合成技术进行反转录,正常黏膜组织总mRNA为驱动组,进行扣除杂交,筛选出两组差异表达的cDNA,与T载体进行T/A连接构建文库,然后转化高效感受态大肠杆菌DH5а进行文库扩增,随机挑取阳性克隆进行酶切鉴定.结果:扩增消减cDNA文库获得200余个白色阳性克隆,随机挑取的100个阳性克隆酶切后,含500 bp以上插入片段的克隆64个,占64%.结论:用改良消减杂交技术成功构建了口腔扁平苔藓差异表达基因的消减cDNA文库,该文库的建立为进一步筛选、克隆口腔扁平苔藓相关基因奠定了基础.

舌鳞状细胞癌相关差异基因的生物信息学及预后分析

目的:通过生物信息学方法利用GEO(gene expression omnibus)和TCGA(The cancer genome atlas)数据库分析舌鳞状细胞癌(tongue squamous cell carcinoma,TSCC)发生、发展的相关分子标志物及其预后.方法:从NCBI (美国国立生物技术信息中心)的GEO数据库下载相关芯片数据(GSE78060),运用GEO2 R进行差异表达基因筛选,GO及KEGG对差异表达基因进行相关功能及通路富集分析,同时使用STRING及Cytoscape软件构建相互作用网络,筛选出核心基因(Hub gene),结合TCGA数据库附带的临床信息对Hub gene进行预后分析.结果:筛选出筛选出861个差异基因,其中上调342个,下调519个.GO、KEGG分析及蛋白相互作用网络筛选出现VEGFA、ITGA3、COL1 A1、COL17 A1为Hub gene.生存分析显示高表达VEGFA、ITGA3是预后的危险因素.结论:VEGFA、ITGA3可以作为TSCC发生、发展的相关生物标志物,与TSCC患者预后相关,为TSCC的进一步研究提供依据.

胶质母细胞瘤基因表达谱芯片的生物信息学分析

目的 利用生物信息学方法分析胶质母细胞瘤基因表达谱芯片,从转录水平探讨胶质母细胞瘤与正常组织的差异表达基因的功能及相互作用.方法 从公共数据平台GEO中下载了81例胶质母细胞瘤组织和23例来源于癫痫患者的非肿瘤组织基因表达数据,利用R语言包筛选差异表达基因,进一步利用DAVID、STRING数据库对差异表达基因进行GO、KEGG富集分析、蛋白相互作用分析.结果 在胶质母细胞瘤中共筛选出相对于正常组织差异表达基因823个,上调基因214个、下调基因609个.GO分析显示差异表达基因主要涉及细胞连接、突触化学信号传导、轴突及突触等生物学过程,KEGG分析提示其在包括尼古丁成瘾、吗啡成瘾、γ氨基丁酸能突触、突触囊泡循环以及ECM-受体相互作用、ErbB信号通路、HIF-1信号通路、RAS信号通路等32个通路中富集.利用STRING数据库进一步分析差异基因的蛋白-蛋白相互作用网络.结论 利用生物信息学方法能有效对胶质母细胞瘤基因芯片数据进行挖掘,为进一步研究胶质母细胞瘤发生发展机制及寻找潜在的药物治疗靶点提供参考.

基因芯片检测经壳聚糖处理后变形链球菌生物膜细菌与脱落菌的基因差异

目的 采用基因芯片技术检测经壳聚糖处理后的变形链球菌脱落菌与生物膜细菌的差异表达基因.方法 在盖玻片上形成48 h变形链球菌生物膜,加入浓度约为2.5 g/L,相对分子量为2000的壳聚糖溶液,作用15 min,分别收集脱落的变形链球菌及生物膜细菌,分别提取RNA,逆转录为cDNA后进行基因表达谱芯片杂交.对所得数据进行分析.结果 经壳聚糖处理的变形链球菌生物膜脱落菌与生物膜细菌存在较多的差异基因.其中,参与转运功能、感受态、信号传导的基因在生物膜细菌中显著上调,介导蔗糖依赖性粘附,参与生物膜形成,诱导耐酸性反应的产生;同时,参与能量代谢和转录调节的基因在生物膜细菌中显著下调.结论 壳聚糖通过影响粘附、耐酸相关基因、信号传导相关基因使生物膜细菌脱落.

一种从微阵列提取相关基因的非参数得分系统及其界值确定方法

用一种非参数得分方法研究了如何从DNA微阵列中筛选相关基因(信息基因).该方法能够从复杂的原始数据中识别相关基因且不受原始数据分布特征的影响,大大减少了进一步寻找致病基因需要分析的数据量,是一种鲁棒的微阵列数据预处理方法.

cDNA代表性差异分析:方法及其应用

分析基因表达的差异不仅在研究发育、分化、突变等领域有着极大的应用价值,已成为基因克隆非常有效的手段之一.cDNA代表性差异分析(cDNA RDA)是新近出现的一种新的、具有一定优越性的mRNA差异表达分析方法,本文简要介绍了cDNA RDA的原理、方法,以及它和其它几种常用的mRNA差异表达分析技术如DD-PCR、消减杂交、抑制消减杂交等进行了比较.

内镜保胆胆囊组织结石复发易感基因调控研究

目的 采用高通量测序技术通过对胆囊结石复发患者胆囊黏膜中基因表达谱的检测及生物信息学的分析,初步了解基因在胆囊结石发生发展中的作用机制.方法 用Illumina HiSeq 2500新一代高通量测序技术对7例胆囊结石及2例胆囊息肉复发患者进行mRNA表达谱差异筛选分析,并对得到的数据进行Gene Ontology(GO)和京都基因与基因组(KEGG)显著性富集统计.结果 高通量测序结果显示,差异表达的mRNA差异基因共有150条.通过GO功能显著性富集分析,发现分子功能的GO功能显著富集是抗原结合;而对于生物过程,富集的GO功能是免疫应答;对于细胞成分,富集的GO功能是细胞外区域.KEGG通路富集分析发现显著的途径是细胞因子-细胞因子受体作用途径(P=0.000).结论 目前的研究表明,研究胆囊结石复发易感基因,可以为预防内镜保胆术后胆囊结石复发的科学研究工作及临床治疗提供一个重要的参考.

基因芯片在同型半胱氨酸诱导动脉粥样硬化基因表达谱变化中的应用

应用基因芯片技术研究同型半胱氨酸诱导动脉粥样硬化的基因表达谱变化.选取3例无冠心病传统危险因素的住院患者,其中1例为血同型半胱氨酸正常的冠状动脉造影正常者,1例为血同型半胱氨酸正常的冠心病患者,1例为高同型半胱氨酸血症的冠心病患者.分离外周血淋巴细胞并抽提总RNA,逆转录制备杂交探针,应用含有1152条基因的人类表达谱芯片进行差异表达谱分析. 结果发现,高同型半胱氨酸血症的冠心病患者与血同型半胱氨酸正常的冠状动脉造影正常者比较差异表达的基因177条(组一),高同型半胱氨酸血症的冠心病患者与血同型半胱氨酸正常的冠心病患者比较差异表达的基因有151条(组三).组一与组三基因芯片平行比较,二者共同的差异表达基因48条,其中上调基因23条,下调基因25条. 结果提示,在差异表达的基因中,有些是凋亡、信号转导、免疫、蛋白质合成及原癌基因等的相关基因,这些基因可能与同型半胱氨酸致动脉粥样硬化发生有关.应用基因芯片技术研究同型半胱氨酸诱导动脉粥样硬化差异表达谱,可能为动脉粥样硬化发病机制研究提供新的思路.

从热休克因子1基因敲除小鼠心肌组织中筛选应激反应中受热休克因子1调控的靶基因

2型糖尿病患儿基因表达谱的改变及其发病机制

目的:探讨儿童2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)的发病机制,为其早期诊断和医治提供基因组学证据.方法:从美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)的高通量基因表达数据库(gene expression omnibus,GEO)中检索得到12例T2DM患儿和24例健康儿童的外周血基因芯片数据集,利用R语言软件筛选出差异表达基因,并采用GenCLiP 2.0,STRING及Cytoscape等软件分析两组差异表达基因有关的生物学功能、蛋白质相互作用网络、信号通路、基因-通路相互作用、关键基因的表达状况和预测价值评价.结果:共筛选出79个差异表达基因,其中表达上调的有58个(73.42％),表达下调的有21个(26.58％),差异表达基因主要涉及防御反应、对外刺激反应、炎症应答等分子功能和生物学过程,主要参与利什曼病、细胞因子及其受体的相互作用、Toll样受体信号通路等;白细胞介素1β(interleukin 1 beta,IL-1β)、jun原癌基因(jun proto-oncogene,JUN)和IL-8是蛋白-蛋白相互作用网络中典型子网络的3个重要链接节点;JUN和IL-1β基因是关键基因,其均与1L-17信号通路、Toll样受体信号通路等有关;T2DM患儿外周血的JUN基因表达下降,IL-1β基因表达升高;JUN和IL-1β基因对儿童T2DM均具有一定的诊断和预测价值.结论:T2DM患儿外周血的基因表达谱发生了明显改变,JUN和IL-1β基因与儿童T2DM关系密切,IL-1β基因表达水平对儿童T2DM的预测效果较好.