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母牛分支杆菌菌苗对结核病小鼠IFN-γ和IL-4m RNA表达影响的研究
目的 从基因水平探讨母牛分支杆菌的抗结核保护性免疫机理。方法 BALB/C小鼠随机分为三组：结核病模型组(A)；攻毒后微卡免疫组(B)及正常对照组(N)。感染四周后将全部小鼠处死。小鼠肺组织做病理切片进行HE染色，脾脏组织进行RT-PCR以检测IFN-γ和IL-4的mRNA表达。结果 三组小鼠脾脏中均可检测到IFN-γ的mRNA表达，但以B组表达强；只有A组可检测到IL-4 mRNA表达，其余两组未见目的带；B组小鼠肺部病变较A组轻而且局限。结论 母牛分支杆菌菌苗可以通过促进IFN-γ的mRNA表达抑制IL-4的mRNA表达来增强机体的抗结核保护性免疫。
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ING1在人脑胶质瘤中的表达变化及临床意义
目的:探讨生长抑制基因ING1在脑胶质瘤中的表达情况及其临床意义.方法:采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法,检测42例人脑胶质瘤标本与10例非瘤脑组织中ING1基因的表达.结果:人胶质瘤组织和非瘤脑组织中ING1mRNA表达水平存在明显差别(P＜0.05),ING1在Ⅲ～Ⅳ级中表达水平低于Ⅰ～Ⅱ级(P＜0.05).结论:ING1mRNA表达水平的异常在胶质瘤的发生和发展过程中起着重要作用,对ING1的检测,对胶质瘤的诊断与治疗具有积极意义.并为基因治疗方面提供了依据.
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汕头地区690例急性呼吸道感染患儿中人冠状病毒NL63的检测及分析
目前所确定的人冠状病毒增至5种:HCoV-229E、HCoV-OC43、SARS-CoV、HCoV-NL63及HCoV-HKU1~[1,2].其中,HCoV-NL63已在国外及国内北京~[3]、福州~[4]等地区检测发现.为了解HCoV-NL63在汕头地区的流行情况及其所致疾病的特点,对该病毒核酸进行检测及相关分析.
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温胆汤对高脂血症大鼠脂质代谢的影响
目的:探讨温胆汤对高脂血症大鼠低密度脂蛋白受体基因表达的影响.方法:在建立大鼠高脂血症模型基础上,观察温胆汤对大鼠血脂水平、总脂解酶(LA)、脂蛋白脂酶(LPL)和肝脂酶(HL)活性以及肝脏低密度脂蛋白受体(LDLR)基因表达的影响.结果:温胆汤能显著抑制高脂模型大鼠血清总胆固醇(TC)、血清总甘油三酯(TG)浓度,提高LPL和LA活性,但对.HL活性无明显影响;逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)实验显示高脂模型大鼠肝脏LDLR mRNA表达降低,温胆汤能显著上调高脂血症大鼠肝脏LDLR mRNA水平.结论:温胆汤可能通过调节大鼠肝脏LDLR转录水平预防脂质代谢紊乱.
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抑制核因子-κB对人眼角膜基质细胞分泌细胞因子的影响
目的 观察体外抑制核因子-κB (NF-κB)对人眼角膜基质细胞分泌细胞因子的影响. 方法 四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测不同浓度的大黄素对人眼角膜基质细胞活性的影响.用脂多糖(LPS)刺激体外培养的基质细胞,将细胞分为正常对照组(n=6)、LPS组(n=24)和大黄素组(n=24).LPS组单纯给予LPS刺激,大黄素组于LPS刺激前先用大黄素预处理30min,其余处理同LPS组.分别用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和酶联免疫吸附实验(ELISA)检测LPS刺激对角膜基质细胞白细胞介素8(IL-8)基因表达和蛋白分泌的影响,Western blotting检测角膜基质细胞中κB抑制因子α(IκB-α)蛋白的表达. 结果 所用浓度大黄素对体外培养的角膜基质细胞活性无影响.与刺激前相比,LPS刺激可引起人眼角膜基质细胞IL-8 mRNA表达增加,促进IL-8蛋白分泌、下调细胞内IκB-α蛋白水平,P＜0.01差异均有统计学意义.大黄素预处理可明显抑制LPS诱导的人眼角膜基质细胞表达IκB-α,下调细胞IL-8基因表达,减少IL-8蛋白分泌,明显低于同时间点LPS组的表达,P＜0.01差异具有统计学意义. 结论 LPS可引起人眼角膜基质细胞IκB-α的降解,促进NF-κB核转位,引起IL-8表达.体外抑制NF-κB,能减少人眼角膜基质细胞分泌IL-8.
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DDX3和酪蛋白激酶1ε在肌萎缩侧索硬化症转基因鼠脑干中的表达变化
目的 检测DDX3和酪蛋白激酶1ε(CK1ε)在肌萎缩侧索硬化症(ALS)转基因鼠脑干中的表达变化,探讨DDX3和CK1ε在ALS脑干运动神经元变性中的作用.方法 选取ALS转基因鼠33只,分别于发病早期(95 d)、中期(108 d)和晚期(122 d)3个时间点剥离脑干,应用RT-PCR、Western blotting和免疫荧光染色技术分别检测ALS转基因鼠脑干组织中DDX3和CK1ε的表达规律,在脑干运动核团舌下神经(12 N)和面神经(7 N)中阳性细胞的分布特点及细胞定位,每组均选择相同数量的同窝野生型鼠作为对照.结果 RT-PCR和Western blotting 结果显示,与同窝野生型鼠相比,ALS转基因鼠脑干组织中DDX3和CK1ε mRNA于95 d、108 d、122 d表达均无明显变化,DDX3和CK1ε蛋白在95 d和108 d表达上调,122 d表达下调(P＜ 0.01,P＜0.001).免疫荧光结果显示,在ALS鼠和野生型鼠脑干的12 N和7N区域均可检测到DDX3和CK1ε阳性细胞,DDX3和CK1ε表达在神经元,在星形胶质细胞不表达.ALS鼠和野生型鼠DDX3和CK1ε免疫反应性具有差异.结论 DDX3和CK1ε在脑干中的表达异常与ALS发病密切相关.
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体外诱导人骨髓基质干细胞向角膜上皮样细胞的分化
目的 探讨体外诱导人骨髓基质干细胞(HMSCs)向角膜上皮样细胞分化的可能性.方法 组织块培养法原代培养人眼角膜基质细胞(HCFs)并进行传代培养;密度梯度离心法分离、培养HMSCs;倒置相差显微镜观察细胞的形态学特征;免疫细胞化学对细胞进行鉴定.利用角膜上皮细胞生长的微环境对处于共培养体系的HMSCs进行诱导培养;免疫细胞化学检测角膜上皮细胞的特异性分子标志角蛋白12(CK12)在分化细胞的原位表达;反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测分化细胞CK12 mRNA的表达,用单独培养的HMSCs做对照.结果 HMSCs和HCFs贴壁生长,以梭形为主,接近汇合的细胞排列有一定方向性,呈漩涡状;HMSCs阳性表达CD29;HCFs阳性表达波形纤维蛋白;随着共培养时间的延长,HMSCs形状逐渐由长梭形变为不规则多边形,与上皮细胞的形态相似;免疫细胞化学和RT-PCR分别在蛋白和基因水平证实分化细胞表达CK12.结论 在一定诱导条件下,体外培养的HMSCs可向具有角膜上皮细胞表型的上皮样细胞分化.
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白藜芦醇抑制脂多糖诱导破骨前体细胞Raw 264.7的激活
目的 探讨白藜芦醇(Res)对脂多糖(LPS)诱导的破骨前体细胞Raw 264.7细胞系释放炎性细胞因子的抑制作用.方法 采用LPS刺激Raw 264.7细胞构建炎症模型,采用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色鉴定细胞,采用MTT检测Res对Raw 264.7细胞的毒性影响,免疫荧光双标以及反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测不同浓度Res(1μmol/L和5μmol/L)对细胞炎性因子:肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-1B (IL-1B)与细胞炎性蛋白酶:诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和环氧合酶-2(COx-2)、炎性信号蛋白核因子-κB (NF-κB)蛋白与mRNA的表达变化.结果 不同浓度的Res(1μmol/L和5μmol/L)在翻译水平和转录水平上明显抑制了LPS诱导的细胞炎性蛋白酶iNOS和COX-2表达,同时了抑制细胞炎性因子IL-1β与炎性信号蛋白NF-κB的上调.结论 Res可能通过NF-κB调控LPS诱导的Raw 264.7细胞炎性细胞因子的释放进而抑制破骨前体细胞的激活,进而具有抗骨质疏松的作用.
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ROBO4在上皮性卵巢癌组织和血清中的表达及临床意义
目的 探讨ROBO4在上皮性卵巢癌组织和血清中的表达及其在卵巢癌发生发展中的作用.方法 采用免疫组织化学和反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测110例卵巢癌,54例卵巢良性肿瘤,40例正常卵巢组织中ROBO4蛋白和ROBO4mRNA表达,比较其表达与卵巢癌临床病理特征的关系;并采用ELISA检测卵巢癌、卵巢良性肿瘤和正常人血清中ROBO4表达水平.结果 卵巢癌组织中ROBO4蛋白和ROBO4mRNA表达显著低于正常对照组和卵巢良性肿瘤组(P＜0.05);上皮性卵巢癌血清中ROBO4的表达明显低于卵巢良性肿瘤和正常人(P＜0.05);卵巢癌组织中ROBO4表达降低与卵巢癌FIGO分期、淋巴结转移、大网膜转移和腹水相关(P＜0.05);卵巢癌组织中ROBO4表达与年龄、组织学类型和病理分级无相关性.卵巢癌患者血清ROBO4、CA125的相关分析显示,两者之间无相关性.结论 在卵巢癌发生过程中ROBO4表达降低起到重要作用,表达异常的ROBO4与卵巢癌的侵袭转移能力相关,并与卵巢癌的临床病理学特征有明显的相关性.
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枸橼醛在急性早幼粒细胞白血病细胞系K562中的作用
目的 探讨枸橼醛(citral)在急性早幼粒细胞白血病细胞系K562中的作用.方法 Citral作用于体外培养K562细胞系,分别用Wright-Giemsa染色观察细胞凋亡形态;MTT法计算细胞增殖能力;DNA电泳分析DNA碎片;Annexin V-FITC/PI分析细胞凋亡变化;RT-PCR法检测凋亡通路蛋白Bcl、Bax的表达水平变化;流式细胞术分析线粒体膜电位、Caspase-3和核因子(NF)-KB水平变化.结果 Citral以时间和剂量依赖性方式诱导K562细胞凋亡,citral能够诱导线粒体膜电位减少.证实citral诱发细胞凋亡是依赖线粒体途径.结论 Citral对白血病有潜在的治疗效果,有一定的临床应用前景.
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沉默DLL3基因增强白血病K562/ADM细胞对阿霉素的敏感性
目的 探讨沉默Delta-like ligand 3(DLL3)基因对白血病K562/ADM细胞对阿霉素(ADM)耐药性的影响及其分子机制.方法 将干扰人DLL3基因表达的shRNA质粒和无义对照质粒转染K562/ADM细胞,采用RT-PCR法检测DLL3的mRNA表达水平,采用CCK-8法检测ADM对K562和K562/ADM细胞的毒性作用,采用流式细胞术检测细胞凋亡和细胞内ADM浓度,采用Western blotting方法检测DLL3、谷胱甘肽S转移酶-π(GST-π)和P-糖蛋白(P-gp)的蛋白表达水平.结果 K562/ADM细胞DLL3的mRNA和蛋白表达水平均显著高于其亲代K562细胞(P＜0.05);ADM对K562和K562/ADM细胞的IC50分别为1.08 mg/L和34.93 mg/L;沉默DLL3基因后,K562/ADM细胞的耐药倍数下降至13.12,反转倍数为2.47;尽管抑制DLL3基因表达未对K562/ADM细胞凋亡产生影响,但可下调P-gp和GST-π的蛋白表达水平(P＜0.05),增加K562/ADM细胞内ADM的蓄积量(P＜0.05),从而增强ADM诱导的K562/ADM细胞凋亡(P＜0.05).结论 沉默DLL3基因可反转K562/ADM细胞对ADM的耐药性,这可能与下调P-gp和GST-π蛋白水平、从而减少K562/ADM细胞内阿霉素蓄积量有关.
关键词： DLL3基因 K562/ADM细胞 P-糖蛋白 谷胱甘肽S转移酶-π 反转录聚合酶链反应 白血病 人 -
清胰汤对急性坏死性胰腺炎大鼠基因表达谱的影响
目的 探讨清胰汤(QYD)对牛磺胆酸钠诱导的急性坏死性胰腺炎(ANP)大鼠胰腺基因表达谱的影响.方法 60只SD大鼠按随机数字法分为假手术组(SO组)、ANP组和QYD组,每组20只.4％牛磺胆酸钠胰胆管逆行注射复制ANP模型,SO组注射生理盐水,QYD组3次灌胃治疗(0.75 ml/100 g).观测大鼠存活率、血清淀粉酶和C-反应蛋白(CRP)变化;HE染色观察胰腺、肺组织病理改变;Illumina大鼠全基因组表达谱基因芯片分析胰腺表达谱变化;荧光定量RT-PCR验证部分基因(热休克蛋白A8和热休克蛋白b1).结果 QYD组存活率较ANP组高(80％比65％,P=0.031),而血清淀粉酶、CRP明显下降[(5789±798)比(7256± 1221) U/L,P=0.001;(78.6±18.5)比(126.4±24.3) mg/L,P=0.012],Schmidt胰腺病理评分好转.与ANP组比较,QYD组筛选出575个差异基因,其中上调92个,下调483个.基因本体论(GO)功能分析涉及到转录调节因子活性负调节、氧化还原酶类活性、酶抑制剂活性等.KEGG生物学通路主要涉及丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路、NOD受体样信号通路、细胞周期、代谢通路、氧化还原酶类活性等.定量RT-PCR(热休克蛋白A8和热休克蛋白b1 mRNA)验证了基因芯片结果.结论 QYD可有效治疗实验性ANP,其机制涉及到MAPK信号通路、NOD受体样信号通路、细胞周期、代谢通路、氧化还原酶类活性等.
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高分化及去分化脂肪肉瘤MDM2的检测及其临床意义
目的 研究高分化及去分化脂肪肉瘤石蜡包埋组织中MDM2基因和蛋白表达的可行性及临床意义.方法 收集17例高分化及去分化脂肪肉瘤,对照组肿瘤标本18倒,均为甲醛固定石蜡包埋组织,MDM2基因检测用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)法,以看家基因β-actin为内参照.蛋白检测用免疫组化EnVision二步法.结果 用RT-PCR法检测的10例高分化及去分化脂肪肉瘤均有MDM2基因表达,而对照组肿瘤标本只检测到β-actin基因,未检测到MDM2基因.17例高分化及去分化脂肪肉瘤MDM2蛋白表达率显著高于18例对照组肿瘤标本(P＜0.05).结论 在高分化和去分化脂肪肉瘤石蜡包埋组织中,RT-PCR法检测MDM2基因和免疫组化法检测MDM2蛋白可行,且两者结果对其诊断和鉴别诊断有意义.
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肺癌呼吸道合胞病毒感染与K-ras基因突变的研究
近年肺癌的发生率呈上升趋势,有专家认为人乳头瘤病毒感染与肺癌有关[1,2].我们在临床检测中发现肺癌患者上呼吸道分泌物中的呼吸道合胞病毒(RSV)阳性检出率较呼吸道感染患者高.本研究应用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)结合单链构象多态性分析(SSCP)、免疫组化分析检测39例肺癌手术标本的BSV和K-ras基因.探讨肺癌与RSV感染和K-ras基因突变的关系.
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恙螨体内肾综合征出血热病毒基因的套式PCR检测
目的:检测恙螨体内微量肾综合征出血热病毒(HFRSV)基因.方法:选择HFRSV膜蛋白(MP)基因的保守区核苷酸序列合成两对引物,采用异硫氰酸胍一步抽提RNA,建立了反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测鼠体恙螨及游离恙螨体内HFRSV-RNA的方法,扩增产物经凝胶电泳及点印迹杂交证实具有特异性.结果:HFRSV抗原阳性鼠体恙螨50只组、10只组、游离恙螨50只组,经RT-PCR检测为阳性;HFRSV抗原阳性鼠体恙螨5只组,HFRSV抗原阴性鼠体恙螨50只、10只和5只组,游离螨10只和5只组均未见明显扩增带.进一步用Nested RT-PCR检测,在RT-PCR未检测出HFRSV-RNA各组中均检测有HFRSV-RNA,低检出为5只螨组.并用核酸分子杂交技术进一步证实了上述结果.结论:Nested RT-PCR具有高特异、高敏感的特点,可用于检测恙螨体内微量HFRSV-RNA,从分子生物学角度为恙螨作为HFRSV的传播媒介提供了直接证据.
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MTX对映体耐药A549细胞株中EGFR基因mRNA的表达分析
目的 探讨表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)在氨甲喋呤(methotrexate,MTX)对映体L-(+)-MTX和D-(-)-MTX耐药A549细胞株中的表达.方法 采用RT-PCR方法测定肺癌A549敏感细胞株和15 μmol/L、35 μmol/L、55 μmol/L的L-(+)-MTX和D-(-)-MTX A549耐药细胞株中EGFR mRNA表达情况.结果 15 μmol/L、35 μmol/L、55 μmol/L L-(+)-MTX A549耐药细胞株中EGFR基因表达的mRNA相对含量分别为肺癌A549敏感细胞株的(1.55±0.26)倍、(1.86±0.13)倍、(1.20±0.05)倍.RT-PCR结果显示,A549敏感细胞株和L-(+)-MTX各浓度A549耐药株均扩增出315 bp条带,有EGFR基因表达,而3种浓度的D-(-)-MTX耐药细胞株中EGFR基因不表达.结论 MTX诱导耐药后A549细胞株中EGFR mRNA发生变化,且在3种浓度两种对映体细胞株间具有明显的手性差异,MTX可能通过改变EGFR基因启动子的甲基化状态,影响EGFR的表达.
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Id-1 mRNA在乳腺癌中的表达及与高频彩色多普勒超声表现和病理对照
目的 研究Id-1 mRNA在乳腺癌中的表达,探讨其与彩色多普勒高频超声表现及病理的关系.方法 应用实时荧光定量RT-PCR检测80例乳腺癌样本中Id-1 mRNA的表达,并与乳腺癌的高频彩色多普勒超声表现进行对照分析.结果 Id-1 mRNA在正常组织中表达低于癌组织(P＜0.01);WHO Ⅲ级表达高于WHO Ⅰ级(P＜0.01).超声显示具有毛刺征及周边高回声晕的组织,Id-1 mRNA均呈高表达(P＜0.01);乳腺癌彩色多普勒血流显像Ⅱ～Ⅲ级中Id-1 mRNA的表达高于0～Ⅰ级(P＜0.01).结论 乳腺癌的声像图表现与其病理改变密切相关,乳腺癌的彩色多普勒高频超声征象可在一定程度上反应Id-1 mRNA的表达.
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Survivin siRNA沉默对非小细胞肺癌细胞生物学的影响
目的：探讨凋亡抑制蛋白（Survivin）对非小细胞肺癌（NSCLC）H1299细胞株的生物学影响。方法通过脂质体介导将 Survivin 基因 siRNA 瞬时转染 H1299细胞。采用 RT-PCR及Western blot 检测转染后H1299细胞内Survivin 基因的表达水平。MTT比色法、流式细胞术（FCM）及Western blot观察细胞增殖、凋亡、周期及Caspase-9蛋白表达变化情况。结果 RT-PCR及Western blot证实，siRNA沉默的H1299细胞中Survivin mRNA、蛋白的表达水平较未转染组明显降低（t＝10.970，P＝0.000；t＝9.192，P＝0.003）。MTT、细胞凋亡及周期结果表明，siRNA 沉默的 H1299细胞其增殖能力明显减弱、细胞凋亡明显升高，G2/M期阻滞，Caspase-9蛋白表达增加（t＝8.162， P＝0.001；t＝10.800，P＝0.000；t＝9.192，P＝0.003）。结论 Survivin参与NSCLC细胞增殖、凋亡、周期这一生物学过程。
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反转录聚合酶链反应检测前列腺癌病人外周血中前列腺特异膜抗原
前列腺特异膜抗原(PSM)存在前列腺细胞上,患前列腺癌时,有很少量PSM进入血清,检测病人血清中PSM的水平,对前列腺癌的诊断有一定的临床意义,但该方法的敏感性和特异性均不理想.我们运用敏感的反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法,检测了33例前列腺癌病人外周血中PSM mRNA的表达,结合临床有关资料,探讨其临床意义.
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HeLa细胞感染痢疾杆菌前后差异表达的新EST序列的电子延伸及验证
目的:研究痢疾杆菌福氏2a入侵前和入侵后3 h的人上皮细胞差异表达的新基因.方法:采用增毒的痢疾杆菌福氏2a 2457T侵袭HeLa细胞,检查HeLa细胞中细菌的数量并用RT-PCR方法从HeLa细胞中提取总RNA,制备探针.采用含有约3000个代表新基因的芯片进行芯片杂交,分析杂交结果.将所获得的新的156条EST序列为种子序列用cDNA微阵列实验,以人类EST数据库为基础库,应用SiClone软件进行EST拼接、校对并尽可能延长获得大片段或全长cDNA.选取基因组未注释的编码区序列作为新基因进行RT-PCR实验验证.结果:共鉴定到≥3倍或≤0.33的差异表达的代表新基因的EST序列45条,其中25个延伸序列鉴定为与重要的肠道功能相关的已知基因,并有3个在痢疾杆菌侵袭期间高表达的存在显著差异的新EST序列,他们分别名为:NPCCKHl2、ADBCSB02和HTBAMG05,这3个基因是新的人基因或假基因.结论:鉴定出了在HeLa细胞感染痢疾杆菌前后差异表达的新EST序列,为进一步研究痢疾杆菌与寄主相互作用奠定了基础.
