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8-溴-环腺苷酸对视网膜母细胞瘤细胞系端粒酶活性及动力学影响的研究
目的探讨8-溴-环腺苷酸(8-Br-cAMP)对视网膜母细胞瘤(RB)细胞系端粒酶活性及细胞周期变化的影响.方法将培养的RB细胞系分为对照组及实验组(加8-Br-cAMP培养组),分别进行体外培养24、48、72 h后,以聚合酶链反应-酶标免疫吸附实验方法检测其端粒酶活性,流式细胞仪检测细胞周期变化.结果各实验组RB细胞端粒酶活性与对照组相比,差异均有显著性的意义(P＜0.01).8-Br-cAMP作用不同时间实验组的端粒酶活性吸光度[A,旧称光密度(OD)]值与作用时间之间,呈显著负相关(r=-0.778 9,F=33.936,P＜0.01).实验组细胞周期变化:G1期比率上升,S期比率下降. 结论8-Br-cAMP可减弱RB细胞系端粒酶活性,影响其周期变化,抑制RB细胞系增生.
关键词： 基因表达调控 视网膜母细胞瘤/诊断 细胞周期 端粒 末端转移酶 -
端粒酶在宫颈癌诊断上的应用及常见问题
端粒酶在宫颈癌中有高比例的表达,因此可能是一个很好的肿瘤分子标记物,可用做宫颈癌的辅助诊断.但在临床中用TRAP法检测端粒酶活性时,会由于各种原因而导致结果误差,如能够注意到这些问题,将提高端粒酶检测的正确性.
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皮肤鳞状细胞癌皮损中hTERT mRNA的表达
目的探讨hTERT基因表达在皮肤鳞状细胞癌(鳞癌)进展过程中的作用.方法收集10例正常皮肤、11例假上皮瘤样增生(PEH)、66例皮肤鳞癌原发灶及12例淋巴结转移灶标本和临床、病理学资料,采用原位杂交法检测hTERT mRNA,结果以图像分析方法定量分析.结果hTERT mRNA在正常皮肤、PEH及鳞癌中的阳性系数(PU)分别为0.84±0.58、3.06±1.09和10.01±0.60(P＜0.01),鳞癌与前两者间差异有非常显著性(P＜0.01);高分化与低分化组PU值分别为8.52±0.63和13.42±1.02,差异有非常显著性(P＜0.01);转移组与无转移组、已发生转移病例原发灶与转移灶间差异均无显著性(P＞0.05).结论与正常皮肤、PEH相比,鳞癌中hTERT基因表达明显增高,分化越低表达越强,提示端粒酶激活在鳞癌恶变过程中起了关键作用.
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人成釉细胞瘤中蛋白激酶C-α表达与端粒酶活性的关系
目的:研究蛋白激酶C-α(PKCα)在人成釉细胞瘤(AB)中的表达及与端粒酶逆转录酶(hTERT)的关系,探讨其临床生物学意义.方法:用原位杂交和免疫组化SP法分别检测了AB中hTERT mRNA及PKCα蛋白的表达.同时选取牙源性角化囊肿(OKC)16 例,正常口腔黏膜7例做对比研究.结果:hTERT mRNA在AB中阳性率为94.4%(51/54), OKC中为87.5%(14/16)及1/7正常口腔黏膜有hTERT mRNA表达,组间差异有显著性(P＜0.001).伴随AB的复发与恶变hTERT的表达逐渐增高.PKCα在AB中阳性表达为85.1%(46/54),OKC中为56.2%(9/16),4/7正常口腔黏膜有PKCα阳性,组间差异有显著性(P＜0.01),伴随AB的复发与恶变PKCα阳性表达也随之增高(P＜0.05).hTERT阳性表达与PKCα阳性表达之间经Kendall相关分析rk=1.000,P=0.005呈高度正相关.结论:hTERT与AB的发生发展及临床生物学行为相关,端粒酶活性的释放激活与PKCα的高表达可能正相关.
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hTERT启动子驱动的TRAIL联合放化疗对HeLa裸鼠移植瘤生长抑制的作用
目的:探讨hTERT启动子驱动的TRAIL联合放化疗对宫颈癌HeLa裸鼠皮下移植瘤生长抑制的作用. 方法:将含有hTERT启动子的TRAIL基因载体转染宫颈癌细胞HeLa,检测稳定转染细胞中GFP/TRAIL的表达;实验裸鼠分为基因组,化疗组,放疗组,综合组(基因+放化疗),对照组,每组5只,未转染HeLa组为对照组,不作任何处理;将稳定转染基因载体及未转染的HeLa细胞种植于裸鼠背部皮下,联合放化疗,来观察移植瘤成瘤情况,移植瘤的体积、质量以及质量抑制率的变化. 结果:转染hTERT-TRAIL细胞中GFP/TRAIL(绿色荧光蛋白)表达率高于对照组,有统计学意义 (P＜0.01);各组裸鼠在接种细胞第5～7日全部长出肿瘤小结节,结节出现的时间差异无统计学意义(P＞0.05);转染hTERT -TRAIL细胞与对照组HeLa细胞裸鼠的移植瘤质量相比差异有统计学意义(P＜0.05); hTERT -TRAIL细胞在裸鼠体内所形成的移植瘤生长较慢, 4 wk后肿瘤质量抑制率为43.08%,联合放化疗后肿瘤质量抑制率为61.63%,有统计学意义(P＜0.01). 结论:hTERT启动子驱动的TRAIL对人宫颈癌裸鼠移植瘤有明显的抑制作用,联合放化疗能抑制裸鼠移植瘤的生长. 基因治疗联合放化疗等多途径综合治疗为以后的肿瘤研究和临床治疗提供思路.
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hTERT基因启动子调控HSV-tk/GCV系统对HeLa细胞杀伤作用
目的:研究人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因核心启动子调控的人单纯疱疹病毒胸苷激酶基因/更昔洛韦(HSV-tk/GCV)系统对宫颈癌细胞的体外杀伤作用.方法:构建hTERT基因启动子调控的tk基因真核表达载体pCI-neo/hTERT-tk,分别用脂质体法转染宫颈癌细胞(HeLa)和正常血管内皮细胞(ECV304),新霉素(G418)筛选阳性克隆扩增. 用RT-PCR法比较两种细胞tk基因的表达情况;给予前药更昔洛韦(GCV),用流式细胞术检测hTERT调控的HSV-tk/GCV系统对两种细胞的杀伤作用. 结果:hTERT启动子调控下的HSV-tk/GCV系统对宫颈癌HeLa细胞有明显的杀伤作用,使36.7%的细胞凋亡;而对正常细胞ECV304作用则不明显. 结论:hTERT启动子调控的tk基因治疗是一种具有肿瘤特异性的治疗方法,有望解决肿瘤基因治疗中的特异性杀伤及降低毒副作用等问题.
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SiRNA稳定抑制肝癌细胞hTERT基因的表达
目的: 利用RNA干扰稳定筛选-抑制技术,抑制人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因表达,探讨靶向hTERT基因RNAi与抑制肝癌细胞增殖的时-效关系. 方法: 设计靶向hTERT基因的小干扰RNA,构建重组表达质粒pGenesil-shRNA-hTERT并导入肝癌SMMC-7721细胞株,经G418筛选,建立稳定表达siRNA-hTERT的细胞株. 采用real-time RT-PCR、MTT和PCR-TRAP法同时检测pGenesil-shRNA-hTERT稳定抑制组和未处理SMMC-7721细胞组hTERT基因表达、端粒酶活性及细胞增殖变化. 结果: 在稳定表达pGenesil-shRNA-hTERT的SMMC-7721细胞株中,RNAi效力持续、稳定存在,hTERT mRNA表达、端粒酶活性明显降低,瘤细胞增殖被抑制. 结论: RNA干扰能持续、稳定地抑制靶基因hTERT mRNA表达及肿瘤细胞增殖,是有潜力的基因治疗肿瘤新方法.
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修饰hTERT核心启动子靶向转录FCY1的重组腺病毒的构建及鉴定
目的: 构建并鉴定雌激素反应元件与缺氧反应元件共修饰人端粒酶逆转录酶(hTERT)核心启动子靶向转录酵母胞嘧啶脱氨酶(FCY1)的复制缺陷型重组腺病毒.方法: 构建由雌激素反应元件(ERE)和缺氧反应元件(HRE)串联重复序列共修饰的hTERT核心启动子,将该启动子序列与酵母胞嘧啶脱氨酶(FCY1)基因插入穿梭质粒,用穿梭质粒与辅助质粒共转染HEK 293细胞,获得重组腺病毒载体Ad-EHhT-FCY1,经 PCR鉴定证实后,采用终点稀释试验测定病毒滴度. 结果: 经24HRE与8ERE共修饰的hTERT核心启动子序列经正反向测序均正确;穿梭质粒和辅助质粒共转染的HEK 293细胞,在转染后7～10 d出现了典型的细胞病变反应(CPE), PCR反应能扩增出122bp的目的片段,终点稀释试验测定得到的病毒滴度为6.2×107 pfu*mL-1. 结论: 成功构建并获得高滴度的ERE与HRE串联重复序列共修饰的hTERT核心启动子引导FCY1转录的复制缺陷型重组腺病毒.
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端粒酶逆转录酶基因反义寡核苷酸抑制膀胱癌细胞生长的机制
目的: 探讨端粒酶逆转录酶基因(hTERT)反义寡核苷酸(ASODN)对T24膀胱癌细胞生长的影响及作用机制.方法: 采用脂质体介导技术,将hTERT基因ASODN转染入T24膀胱癌细胞中,应用端粒酶PCR-ELISA法检测端粒酶活性变化,MTT法测定细胞生长变化,流式细胞术观察对细胞周期影响.结果: hTERT基因ASODN作用T24膀胱癌细胞后显著地抑制膀胱癌细胞端粒酶活性,吸光度A值降为0.45.癌细胞生长增殖受限,抑制作用具有序列特异性和剂量依赖性,并出现细胞凋亡现象,凋亡率为14.8%,与SODN 转染组及空白对照组进行比较,有显著性差异(P<0.05).结论: hTERT基因ASODN能特异性抑制T24膀胱癌细胞生长,下调端粒酶活性,促进细胞凋亡.为膀胱肿瘤基因治疗的临床应用提供新靶点.
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永生化人成牙本质细胞样细胞系的建立
目的: 建立永生化人成牙本质细胞系. 方法: 采用脂质体转染法,将人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因导入原代人成牙本质细胞样细胞. 培养液加G418筛选约1 mo后,抗性细胞克隆形成,滤纸片法转移、扩增并连续培养. 检测转染细胞内hTERT的基因整和和表达,初步分析细胞系的生物学特征. 结果: hTERT稳定转染入目的细胞,表达mRNA及其蛋白. 转染后共获得5个细胞克隆,克隆5 b来源的细胞在体外长期连续培养下生长良好,具有较高碱性磷酸酶活性,在转录水平表达成牙本质细胞特异性标志牙本质涎磷蛋白,细胞核型正常. 该细胞系至今传代56代,约6 mo,命名为hTERT-hOd-l. 结论: 建立起永生化人成牙本质细胞样细胞系.
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端粒酶逆转录酶基因hTERT突变表达载体在膀胱癌细胞T24中的表达
目的构建端粒酶逆转录酶基因(hTERT)缺失突变的真核表达载体pEGFP-hTERT,并转入膀胱癌细胞株T24中,观察其稳定表达. 探讨其对端粒酶活性调控机制及成为膀胱肿瘤基因治疗新靶点的可能性. 方法将PCR扩增的hTERT缺失突变体片段用 EcoRI与SalI酶切,并连接到真核表达载体pEGFP-C1上, 构建成hTERT缺失突变的真核表达载体pEGFP-hTERT;利用DNA-磷酸钙共沉淀法将pEGFP-hTERT导入膀胱癌细胞株T24中,应用荧光显微镜、与衰老相关的β-半乳糖苷酶染色等方法观察转染细胞中hTERT-GFP融合蛋白定位表达及对膀胱癌细胞生长的影响. 结果酶切鉴定证实hTERT缺失突变体已克隆到pEGFP-C1的EcoRI与SalI位点之间,在转染细胞中观察到与其融合的绿色荧光蛋白的稳定表达,定位于细胞核内;转染细胞2 wk后与衰老相关β-半乳糖苷酶表达增加,细胞生长受抑制. 结论构建的端粒酶逆转录酶基因hTERT缺失突变真核表达载体pEG FP-hTERT可在膀胱癌细胞T24中稳定表达. 突变型hTERT蛋白可入细胞核中竞争性影响端粒酶的功能,进而抑制膀胱癌细胞的生长.
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端粒酶RNA特异性核酶抑制卵巢癌细胞端粒酶的活性
目的研究端粒酶RNA特异性核酶对卵巢癌细胞活性的抑制作用. 方法用脂质体法将构建好的核酶逆转录病毒载体转染至卵巢癌HO-8910细胞,以MTT比色法检测细胞的生长,应用流式细胞仪分析细胞周期细胞,观察细胞的增殖情况,同时扩增端粒重复序列,结合杂交分析,检测细胞的端粒酶活性. 结果 MTT检测发现转染核酶后的细胞生长的潜伏期延长(48→72 h),对数生长期减缓(4→5 d),流式细胞仪结果显示其G1期比例明显增高(70.0%→80.5%, P<0.01),S期细胞比例明显降低(19.0%→13.7%, P<0.01),细胞增殖下降,细胞的端粒酶活性亦降低. 结论端粒酶RNA特异性核酶能抑制卵巢癌细胞端粒酶活性,抑制细胞增殖.
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构建由缺氧反应元件修饰的hTERT核心启动子引导FCY1基因表达的复制缺陷型腺病毒
目的构建由缺氧反应元件串联重复体修饰的人端粒酶逆转录酶(hTERT)核心启动子引导酵母胞嘧啶脱氨酶FCY1基因表达的复制缺陷型重组腺病毒. 方法人工设计缺氧反应元件串联重复序列,克隆后插入hTERT启动子上游并经测序证实. 将修饰后的hTERT启动子和酵母胞嘧啶脱氨酶基因FCY1插入穿梭质粒,与辅助质粒共转染HEK 293细胞,重组产生复制缺陷型腺病毒. 结果获得了由3倍和6倍缺氧反应元件修饰的hTERT核心启动子引导FCY1基因表达的复制缺陷型重组腺病毒. 结论基于Cre重组酶/loxP的腺病毒载体构建系统操作简便、重组效率高.
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宫颈癌组织中端粒酶活性测定
目的探讨端粒酶活性在子宫颈癌组织发生发展中的作用及临床应用价值. 方法采用PCR-TRAP微孔杂交法检测45例子宫颈癌组织标本和8例正常的子宫颈组织的端粒酶活性. 结果 45例宫颈癌组织中端粒酶阳性表达率为86.6%,其中宫颈癌Ⅰ期27例,阳性率77.7%,宫颈癌Ⅱ期12例,阳性率100%,宫颈癌Ⅲ期6例,阳性率100%. 8例正常宫颈组织中未检测出端粒酶阳性者. 结论端粒酶活性表达在子宫颈癌的发生发展中起重要的作用,端粒酶活性检测对指导宫颈癌的诊断和治疗具有重要意义.
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肿瘤细胞内特异表达TRAIL载体的构建及其在喉癌细胞株Hepa2中的表达
目的: 克隆人可溶性TRAIL(sTRAIL)基因并构建肿瘤细胞特异性真核表达载体,为肿瘤基因治疗的靶向性奠定实验基础. 方法: 提取人外周血淋巴细胞总RNA,采用RT-PCR扩增含有IL-2信号肽和TRAIL凋亡诱导功能区的融合基因,克隆入真核表达载体pGL3-181 hTERT肿瘤特异性端粒酶启动子的下游,构建可分泌表达TRAIL基因的真核表达载体pGL3-181 hTERT /TRAIL.用Western Blotting鉴定喉癌细胞株Hepa2中表达产物.结果: RT-PCR扩增得到了613 bp的cDNA片段.经酶切及测序鉴定,与GenBank中报道的IL-2信号肽和TRAIL凋亡诱导功能区cDNA序列完全一致,成功构建了肿瘤特异性高效分泌表达可溶性人TRAIL的重组真核表达载体pGL3-181hTERT /TRAIL.Western Blotting结果显示,获得的瞬时转染TRAIL在喉癌Hepa2肿瘤细胞中能有效表达.结论: 重组真核表达载体pGL3/TRAIL的成功构建,为肿瘤基因治疗的靶向性提供了可行的理想工具.
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骨肿瘤端粒酶活性检测及其意义
目的:了解端粒酶活性高低与骨肿瘤恶性程度的关系.方法:用TRAP方法和改进的TRAP印染方法,对骨肿瘤组织端粒酶活性进行检测.结果:端粒酶阳性率分别为:骨肉瘤80 6%(29/36例),骨巨细胞瘤80 0%(20/25例),软骨肉瘤85 7%(6/7例),恶性纤维组织细胞瘤100%(2/2例),横纹肌肉瘤100%(2/2例),脊索瘤100%(3/3例),另有9例骨软骨瘤检测,仅有1例(111%)阳性.同时检测17例患者的肿瘤旁肌肉组织或软组织,均未发现有阳性.结论:端粒酶活性与骨肿瘤恶性程度密切相关,是诊断恶性骨肿瘤、判断预后的良好指标.
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良、恶性肾上腺肿瘤组织中端粒酶活性的鉴别意义
目的: 检测肾上腺肿瘤中的端粒酶活性,探讨其在鉴别良恶性肾上腺肿瘤中的价值. 方法: 留取西安交通大学第一医院泌尿外科共手术治疗的肾上腺肿瘤组织标本31例,立即液氮中速冻保存.应用TRAP-ELISA法测定肾上腺肿瘤中的端粒酶活性. 结果: 在肾上腺肿瘤标本31例中,6例阳性,阳性率19.4%,其中恶性肿瘤(肾上腺皮质癌2例,恶性嗜铬细胞瘤1例,肾上腺转移癌2例) 5例端粒酶均为阳性,无功能肾上腺皮质腺瘤1例端粒酶亦阳性. 结论: 良性肾上腺肿瘤一般无端粒酶活性,恶性肾上腺肿瘤具有较强的端粒酶活性,检测肾上腺肿瘤的端粒酶活性有助于鉴别良恶性肾上腺肿瘤.
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脂质体介导端粒酶反义RNA对人乳腺癌细胞MCF-7活性及增殖的影响
的同时,可促进MCF-7细胞凋亡.
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小檗碱对人鼻咽癌CNE-2 细胞端粒酶活性的影响
目的:观察小檗碱(Berberine)对人鼻咽癌CNE-2 细胞端粒酶活性的影响. 方法:不同浓度的小檗碱处理体外培养的人鼻咽癌CNE-2 细胞 72 h ,聚合酶链反应-端粒重复扩增(PCR-TRAP)法测定端粒酶活性, 噻唑蓝(MTT) 法测定细胞增殖抑制.结果:小檗碱可抑制CNE-2 细胞端粒酶活性,随小檗碱浓度增大,端粒酶活性抑制增强.MTT结果显示小檗碱抑制CNE-2 细胞增殖且抑制有浓度依赖性.结论:端粒酶活性的抑制可能是小檗碱发挥抗癌活性的作用机制之一,小蘖碱作为鼻咽癌的辅助治疗可能提高疗效.
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人端粒酶反转录酶基因转染对人胎儿表皮干细胞增殖的影响
目的 探讨外源性人端粒酶反转录酶(hTERT)基因转染对人胎儿表皮干细胞增殖的影响.方法 采用脂质体转染法,将含有hTERT基因的质粒pIRES2-EGFP-hTERT和卒载体质粒pIRES2-EGFP分别导人体外培养的人胎儿表皮干细胞,并用G418筛选法进行抗性克隆的筛选.用RT-PCR和Western blot检测表皮十细胞hTERT mRNA及其蛋白的表达,端粒重复序列扩增法(TRAP)-ELISA检测其端粒酶活性,流式细胞仪检测细胞周期.结果 非转染组和空载体质粒转染组表皮干细胞弱表达hTERT mRNA和蛋白,而质粒转染组表皮干细胞强表达hTERT mRNA和蛋白;与非转染组和窄载体质粒转染组比较,质粒转染组表皮干细胞端粒酶活性的表达量显著升高,G_0/G_1期细胞比例明显下降,而S、G_2/M期细胞比例升高,增殖指数增加.结论 外源性hTERT基因转染能有效增强体外培养的人表皮干细胞hTERT mRNA和蛋白的表达及端粒酶活性,细胞增殖能力明显增强.
