首页 > 文献资料
-
hTERT-siRNA及hTR-siRNA的合成及对Hut78细胞端粒酶活性的影响
目的探讨合成端粒酶逆转录酶(hTERT)基因及端粒酶RNA(hTR)的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)对皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)细胞株Hut78端粒酶活性的影响.方法采用体外转录法分别合成两条hTERT-siRNA及hTR-siRNA.采用siRNA直接处理细胞裂解液及磷酸钙共沉淀法将siRNA转染入Hut78细胞两种处理方式,应用端粒酶重复序列扩增聚合酶链反应(TRAP-PCR)及聚丙烯酰胺凝胶电泳银染检测端粒酶活性的变化.结果体外转录法能高效合成siRNA,产量达22.4μg/40 μL siRNA合成体系.经250 ng siRNA直接处理细胞裂解液后,可高效降低端粒酶的活性,抑制率达87%左右.30 ng siRNA转染细胞36 h后,可降低端粒酶活性20%左右,而250 ng siRNA可降低75%左右.结论体外转录法能高效、快速、大量合成siRNA,针对hTERT及hTR基因的siRNA可明显降低Hut78细胞株的端粒酶活性.
-
端粒酶活性与细胞凋亡在尖锐湿疣患者组织中的表达
目的探讨尖锐湿疣(CA)皮损中端粒酶活性与细胞凋亡表达情况及其两者之间的相关性.方法采用端粒重复序列扩增文件-酶标法(TRAP-ELISA)检测了30例尖锐湿疣患者皮损端粒酶活性,并与正常组织和肿瘤细胞株作对照;原位末端标记法(TUNEL)检测皮损中细胞凋亡.结果27例(90%)尖锐湿疣皮损中端粒酶活性A450值为0.50～2.76,平均1302,明显高于正常皮肤组织,差异有显著性(t=6.12,P＜0.01);24例皮损中有凋亡细胞,占80%,且端粒酶活性与凋亡指数呈显著负相关,r=-0.52,P=0.004.结论端粒酶可以在一些非恶性皮肤病中表达,且影响细胞凋亡,可能参与CA发病.
-
端粒酶在瘢痕疙瘩及其周围外观正常皮肤中的表达
目的探讨端粒酶的活性与瘢痕疙瘩发病的关系.方法采用链霉亲和素-过氧化物酶(SP)免疫组化法,对17例瘢痕疙瘩标本、10例瘢痕疙瘩周围外观正常皮肤标本及9例正常人对照组标本的成纤维细胞中端粒酶的活性进行检测,用SPSS统计软件进行相应统计学分析.结果在瘢痕疙瘩标本中,50.5%的成纤维细胞中端粒酶活性检出阳性,且阳性细胞平均染色较深;在瘢痕疙瘩周围外观正常皮肤标本中,21.1%的成纤维细胞中端粒酶活性检出阳性;在正常人皮肤标本中,7.9%的成纤维细胞中端粒酶活性检出阳性,且阳性细胞平均染色深度明显浅于前两组.各组间两两比较,差异均有显著性(P＜0.05).结论端粒酶的活性增高在瘢痕疙瘩的发病机制中有重要作用.
-
母细胞性浆细胞样树突细胞肿瘤一例
患者女，39岁，因全身散在红斑、结节半年余，进行性加重1个月于2014年4月18日来我院就诊。患者半年前无明显原因发现右上臂出现一红色肿物，不痛不痒且逐渐增大，近1个月发现其背部、肘部出现相同肿物，为进一步明确诊断，就诊于我科。患者自发病以来无发热、关节痛、盗汗、光敏、脱发及体重下降等症状。既往体健，个人史、婚育史无特殊，家族中无类似病史。体检：一般情况尚可，心肺腹等未见明显异常，全身浅表淋巴结未触及。皮肤科检查：右上臂及其下方、肘部和背部可见紫红色浸润性斑块，呈圆形或类圆形，表面光滑，无鳞屑及溃疡，边界清，稍突起于体表，大小从1.5 cm ×1.5 cm 至3.0 cm ×3.5 cm，压之不痛不褪色，中等硬度（图1）。实验室及辅助检查：血常规、肝肾功能、β2-微球蛋白、乳酸脱氢酶、血清肌酸磷酸激酶、红细胞沉降率、蛋白电泳、抗核抗体、抗可提取核抗原抗体（ENA）、抗双链 DNA 抗体、全身 PET/CT 检查均未见异常。皮损组织病理及免疫组化：表皮萎缩，轻度角化，真皮浅层可见无浸润带，其下单一性弥漫性肿瘤细胞增生浸润，部分呈条索状排列，细胞体积中等偏小，胞质少，核不规则，核分裂象易见（图2）；免疫组化：CD4、CD56、CD123、CD34、CD163均阳性，CD31血管阳性、肿瘤细胞阴性，Ki67>85%阳性；CD2、CD3、CD20、粒酶 B （GramB）、EB 病毒编码 RNA（EBER）、髓过氧化物酶（MPO）、脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TDT）均阴性。
-
双启动子杆状病毒介导131I肿瘤靶向治疗的实验研究
目的 构建由人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子调控的NIS基因以及由早期生长应答因子1(Egr1)启动子调控的人纤溶酶原Kringle 5(K5)基因的双启动子重组杆状病毒载体,探讨同时靶向肿瘤细胞与血管内皮细胞的基因治疗模式的可行性.方法 将h TERT启动子和NIS基因片段以及Egr1启动子和K5基因片段分别亚克隆至杆状病毒载体,经草地贪夜蛾卵巢细胞(Sf9)包装并扩增得到重组杆状病毒(Bac-h TERT-NIS-Egr 1-K5),同时将CMV启动子调控的重组杆状病毒(Bac-CMV-NIS-Egr1-K5)以及不含NIS基因或不含K5基因的重组杆状病毒(Bac-h TERT-0-Egr 1-K5、Bac-hTERT-NIS-Egr1-0)作为对照组.采用荧光定量PCR及Western blot分析NISmRNA和蛋白在人宫颈癌细胞HeLa中的靶向表达,以及131I辐射对K5 mRNA和蛋白的表达调控.通过摄碘实验、NaClO4抑制实验以及细胞增殖抑制实验验证NIS蛋白的功能及由其介导的131I抑瘤作用.通过细胞凋亡实验评估K5蛋白对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的促凋亡作用.统计学检验采用方差分析.结果 成功构建重组杆状病毒Bac-hTERT-NIS-Egr1-K5.荧光定量PCR及Western blot显示肿瘤特异性启动子hTERT介导的NIS基因仅在HeLa细胞中有表达,而在正常肺纤维细胞MRC5中无表达.131I可以调控辐射敏感启动子Egr1下游K5基因的转录和翻译.细胞摄碘实验显示Bac-hTERT-NIS-Egr1-K5感染的HeLa细胞摄碘增加了5.6倍,与未加NaClO4组比,其摄碘能被NaClO4显著抑制(F=199.296,P＜0.05).131I对Bac-h TERT-NIS-Egr 1-K5感染的HeLa细胞的抑制效果明显,细胞存活率仅为38.3％.Bac-hTERT-NIS-Egr1-K5感染的HUVEC细胞在131I照射下的凋亡率(30.8％)显著高于Bac-h TERT-NIS-Egr1-0组和未加病毒组(11.2％和10.9％,F=19.926、45.409,均P＜0.05).结论 重组杆状病毒Bac-h TERT-NIS-Egr 1-K5可使NIS基因在肿瘤细胞中靶向表达并介导131I的摄取,同时还可通过131I照射调控血管内皮细胞K5基因的表达,为开展体内NIS介导的131I摄取与K5介导的抗血管生成的协同治疗研究提供了实验依据.
-
As2O3诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡与细胞内端粒酶活性关系的研究
目的:探讨As2O3对HeLa细胞的诱导凋亡作用及对HeLa细胞端粒酶活性的影响.方法:采用不同浓度的As2O3作用于人宫颈癌HeLa细胞不同生长时间段(24、48、72 h)后,显微镜下观察细胞凋亡,四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法)测定细胞生长抑制情况,TRAP-ELISA方法测定细胞内端粒酶活性变化.结果:2 μmol*L-1的As2O3处理HeLa细胞48 h后可降低细胞存活率,诱导细胞凋亡,细胞内端粒酶活性比对照组明显下降.随着As2O3 浓度增加、作用时间延长,作用效果越明显.结论:As2O3诱导HeLa细胞凋亡可能与其抑制细胞内端粒酶活性有关.
-
骨髓增生异常综合征骨髓细胞端粒酶活性和端粒酶逆转录酶的表达
目的探讨骨髓增生异常综合征(MDS)骨髓细胞端粒酶活性与端粒酶逆转录酶表达的关系及临床意义.方法采用端粒重复序列扩增-酶联免疫吸附试验(TRAP-ELISA)检测端粒酶活性,RT-PCR法检测端粒酶逆转录酶(hTERT)mRNA水平的表达.结果高危组MDS患者骨髓细胞端粒酶活性较低危组MDS患者骨髓细胞端粒酶活性明显增高(0.200±0.225 vs 0.027±0.013,P=0.037);正常人、缺铁性贫血(IDA)患者和低危组MDS患者骨髓细胞hTERT mRNA表达检测结果均阴性,而高危组MDS患者和急性白血病(AL)患者骨髓细胞均表达hTERT基因;hTERT mRNA表达和端粒酶活性呈正相关(r=0.774,P=0.024).结论端粒酶活性与hTERT基因mRNA水平的异常表达能反映出MDS病情的进展.定期检测MDS患者骨髓细胞端粒酶活性和hTERT mRNA水平的表达可作为观察MDS患者病情变化的指标之一.
-
胃癌癌前病变端粒酶活性检测的临床意义
目的通过检测胃黏膜不同病理类型的端粒酶活性,探讨胃癌发生发展进程中端粒酶活性的变化规律及胃癌癌前病变端粒酶活性检测的临床意义.方法采用TRAP-PCR银染定性及TRAP-PCR-EILIA定量法,对浅表性胃炎、肠上皮化生、不典型增生、胃癌的胃黏膜活检组织的端粒酶活性进行检测.结果端粒酶阳性率及活性水平:胃癌＞不典型增生＞肠上皮化生＞浅表性胃炎,肠上皮化生、不典型增生、胃癌分别与浅表性胃炎比较,差异有高度显著性(P＜0.01),胃癌与肠上皮化生、不典型增生分别比较,差异有高度显著性(P＜0.01);不完全结肠型肠化生的端粒酶活性水平高于完全结肠型、完全小肠型、不完全小肠型等肠化生(P=0.0105),中度不典型增生的端粒酶活性水平高于轻度不典型增生(P=0.0302).结论端粒酶的活化、活性上调是胃癌癌变过程中的早期事件,胃癌癌前病变肠化生、不典型增生端粒酶活性上调者可能更具恶变倾向,临床上对指导其治疗和评价预后有一定意义.
-
靶向端粒酶治疗肿瘤研究进展
近年来,随着对端粒酶的研究深入,应用靶向端粒酶的方法治疗肿瘤成为热点,并有较多的新进展,如:应用端粒酶hTERT的免疫抗原性进行肿瘤的免疫治疗;端粒酶启动子驱动的肿瘤基因治疗等.本文简要介绍端粒酶与肿瘤的密切关系,并就针对端粒酶靶向治疗肿瘤的研究进展进行综述.
-
端粒酶与癌基因
自从人们在四膜虫细胞提取物中发现端粒酶后,揭开了体细胞有限复制、生殖细胞无限繁殖的奥秘.但在欣喜于端粒酶能使细胞永生化的同时,也发现其参与了肿瘤细胞的转化.在此过程中,癌基因的活化和抑癌基因的失活亦是关键步骤.曾有人比喻,癌基因是油门,抑癌基因是刹车,端粒酶是油箱.当汽油充足,可以驱动、加速汽车时,油门、刹车就能发挥作用.而当汽油耗竭,汽车停止时,无论怎样踏油门或刹车都是毫无意义的.显然,端粒酶和癌基因有着密切的关系.
-
端粒酶逆转录酶基因多态性与肝癌的易感性研究
[目的]探讨人类端粒酶逆转录酶(TERT)基因位点(rs2075786、rs2736098)单核苷酸多态性(SNP)与肝癌的易感性.[方法]采用聚合酶链反应—限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)检测肝癌患者165例、非肝癌乙肝病毒感染者195例、健康对照者402名的hTERT基因型分布.[结果]肝癌组患者rs2075786位点TC及TT基因型频率显著高于对照组、非肝癌HBV感染者及所有非HCC者(P均＜0.05),携带TC及TT基因型者罹患肝癌的风险分别增加1.88倍和2.72倍,且男性肝癌患者携带TC及TT基因型明显增加.与对照组、非肝癌HBV感染者及所有非HCC者相比,肝癌组rs2736098位点各基因型分布差异无统计学意义,多态性与肝癌患者的性别、年龄、肿瘤分化程度及TNM分期无相关性.[结论]hTERTrs2075786基因多态性与肝癌易感性相关.
-
胃癌大肠癌端粒酶基因 hTR表达
[目的]探讨胃癌和大肠癌中端粒酶基因hTR表达与临床参数的关系,评价hTR表达检测在胃癌和大肠癌诊断中的价值.[方法]用原位杂交的方法检测端粒酶基因hTR在胃癌、大肠癌、胃癌和大肠癌癌旁组织、胃和大肠良性病变中的表达和分布情况.[结果]57例胃癌中hTR基因表达阳性率为94.7%(54/57);57例癌旁组织中hTR基因表达阳性率为0(0/57);69例胃良性病变中hTR基因表达阳性率为2.9%(2/69).胃癌组织中hTR基因的表达与癌旁组织、胃良性病变比较差异有显著性(P均<0.001).胃癌组织中hTR的表达与肿瘤分化程度、淋巴结转移相关(P均<0.05),与肿瘤分期无相关性(P>0.05).51例大肠癌中hTR基因表达阳性率为94.1%(48/51);51例癌旁组织中hTR基因表达阳性率为0(0/51);31例大肠良性病变中hTR基因表达阳性率为3.2%(1/31).大肠癌组织中hTR基因的表达与癌旁组织、大肠良性病变比较差异有显著性 ( P均 <0.001) . 大肠癌组织中 hTR的表达与患者性别、病变部位、病理分类大体类型、淋巴结转移和临床分期无相关性 ( P均 >0.05) ,与肿瘤病理分级相关 ( P<0.05) . [结论 ] 端粒酶基因 hTR表达检测在胃癌和大肠癌的诊断中可能有一定的价值 .
-
端粒酶催化亚基和C-myc在大肠癌中的表达
采用免疫组化SP法检测78例大肠癌组织、20例癌旁组织和20例大肠腺瘤中hTERT和C-myc蛋白的表达,并分析其相关性.大肠癌中hTERT和C-myc蛋白表达率高(P＜0.05);hTERT和C-myc蛋白表达水平与大肠癌的临床分期、分化程度和淋巴结转移密切相关(P＜0.05);hTERT和C-myc蛋白之间存在显著相关性(P＜0.05).
-
苦参素改变端粒酶活性对人肝癌细胞株HepG2、QGY体外增殖影响的研究
[目的]观察苦参素对人肝癌细胞株HepG2、QGY体外增殖和端粒酶活性的影响.[方法]应用MTT法检测HepG2与QGY增殖抑制的程度;流式细胞仪分析细胞周期的分布及凋亡;PCR-ELISA法检测端粒酶活性的变化.[结果]苦参素对HepG2和QGY细胞增殖的抑制随着时间的延长而增加,具有时间依赖性,各浓度时间之间均有显著性差异(P＜0.001);从细胞周期分析,苦参素能阻滞HepG2和QGY细胞周期进程,同时诱导细胞凋亡,各细胞之间均有显著性差异(P＜0.001);苦参素对细胞端粒酶均有时间和剂量依赖性,各组间均有显著性差异(P＜0.001).[结论]对端粒酶活性的抑制可能是苦参素发挥抗肿瘤作用的机制之一.
-
靶向人端粒酶逆转录酶启动子在肿瘤基因治疗中的研究进展
人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子具有在端粒酶阳性的肿瘤细胞中特异高表达的特点,使其成为肿瘤基因治疗较为理想的靶点.国内外学者利用hTERT启动子构建靶向肿瘤细胞的特异性表达载体也已经取得了较大进展.全文就hTERT启动子靶向治疗肿瘤的一些策略作一综述.
-
紫外线诱导人角质形成细胞衰老的作用与端粒酶表达无关
目的:探讨人永生化角质形成细胞(HaCaT)和人皮肤原代角质形成细胞(HEKa)接受紫外线照射后的衰老机制及其凋亡、坏死和细胞周期的改变. 方法:中波紫外线(UVB)小剂量、多次照射HaCaT细胞和HEKa细胞,以细胞衰老β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)化学染色法观察细胞衰老状态,流式细胞术检测细胞凋亡、坏死和细胞周期阻滞情况;ELISA法检测细胞内超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)水平;Western blot检测redox蛋白p66Shc的表达;RT-PCR法检测细胞内人端粒酶催化亚单位(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)基因在UVB照射前后的表达情况.结果:UVB照射后,SA-β-Gal细胞化学染色结果显示HaCaT细胞和HEKa细胞均呈现强阳性染色.HaCaT细胞的凋亡率从(1.81±0.25)%增至(4.43±0.28)%,坏死率从(0.05±0.01)%上升至(0.10±0.03)%,但细胞周期未见明显阻滞;HEKa细胞的凋亡率从(0.65±0.05)%增至(59.53±2.35)%,坏死率达(3.89±0.24)%,较对照组显著增加(P＜0.05),且细胞周期大部分阻滞于G0/G1期.HaCaT细胞和HEKa细胞的细胞内SOD活性经UVB照射后显著下降(P＜0.05),而MDA水平则明显增高.p66Shc蛋白在UVB照射后表达增强.HaCaT细胞在UVB照射前后均高表达hTERT基因,而HEKa细胞不表达hTERT基因.结论:HaCaT细胞和HEKa细胞均可被UVB诱导进入"应激性早衰"状态,此衰老与细胞内氧化应激水平密切相关,而与端粒酶表达无关;但HaCaT细胞的凋亡率、坏死率及细胞周期阻滞情况较HEKa细胞好,这可能与HaCaT细胞高表达端粒酶水平,从而对细胞损伤修复能力及分化调节能力较强有关.
-
人端粒酶逆转录酶和人白细胞介素18融合基因真核表达载体的构建和功能研究
目的:以基因重组技术在真核细胞中表达人白细胞介素18(hIL-18)和人端粒酶逆转录酶(hTERT)融合基因,并观察其生物学功能.方法:健康人单核细胞经RT-PCR扩增hIL-18后、T-A克隆.亚克隆至经Nhe Ⅰ、Hind Ⅲ酶切的PCDNA3.1(+)/hTERT中,限制性内切酶验证后,挑选出含有目标基因的正确克隆.经限制性内切酶和DNA测序分析两个基因是否已经正确连接到真核表达载体中.将hTERT/hIL-18融合基因质粒脂质体介导转染3T3细胞中表达,经Western-blot验证目的基因表达产物,同时对转染细胞作免疫荧光染色.以ELISA检测转染细胞刺激KG-1细胞分泌γ干扰素的能力,以流式细胞仪检测转染细胞抗MTX诱导凋亡的能力.结果:hTERT/ hIL-18融合基因的真核表达载体PCDNA3.1(+)构建成功,经限制性内切酶验证和DNA测序及同源性对比分析,该基因片段与NCBI基因库hIL-18和hTERT基因CDS序列同源性均达到99.9%;而细胞转染后经Western-blot验证,hTERT/hIL-18融合蛋白的分子量约127 kMr,与预期一致,荧光显微镜观察显示融合蛋白在细胞中弥散表达.此融合蛋白能刺激KG-1细胞分泌γ-干扰素,并具有抗MTX诱导凋亡的生物学功能.结论:本实验构建的PCDNA3.1(+)/hTERT- hIL-18质粒能够在真核细胞中表达,并具有生物学功能,为进一步转染树突状细胞,研制肿瘤的治疗性疫苗提供基础.
-
顺铂对宫颈癌HeLa细胞增殖的抑制作用
目的观察顺铂对HeLa细胞增殖、端粒酶活性及增殖细胞核抗原(PCNA)表达的影响,以揭示顺铂抗宫颈癌的机理.方法运用体外细胞培养技术,以不同浓度的顺铂作用于培养的HeLa细胞72小时,采用MTT法测定细胞代谢率,用端粒酶重复序列扩增-酶联免疫吸附法(TRAP-ELISA)检测细胞端粒酶活性,以流式细胞术观察PCNA的表达.结果顺铂能以浓度依赖方式减低细胞代谢率、下调端粒酶活性并降低PCNA的表达.细胞代谢率减低分别与端粒酶活性的下调(r=0.984)和PCNA表达的降低(r=0.996)均呈正相关,端粒酶活性的下调与PCNA表达的降低也呈正相关(r=0.993).结论顺铂能显著抑制HeLa细胞增殖、下调端粒酶活性并使PCNA的表达降低,这可能是顺铂抗癌作用的重要机理之一.
-
荧光原位杂交检测宫颈上皮脱落细胞人端粒酶基因表达与人乳头瘤病毒的临床应用
目的 研究宫颈癌人端粒酶基因(TERC)的表达情况和宫颈癌人乳头瘤病毒(HPV)感染的相关性,评估荧光原位杂交(FISH)技术检测TERC基因的表达对子宫颈上皮内瘤样病变(CIN)发展到宫颈癌的预测价值.方法 采用FISH技术进行子宫颈上皮脱落细胞TERC基因的检测,实验对象81例,病理正常组20例,CIN1组28例,CIN2组12例,CIN3组9例,宫颈癌组12例.同时利用实时荧光定量聚合酶链反应技术(FQPCR)检测这81例病人的HPV(16/18)感染情况.并进行宫颈癌与TERC基因和HPV的相关性分析.结果 在不同病理分组中TERC基因检测和HPV检测的阳性率差异有统计学意义(P＜0.05),TERC基因检测的阳性率在不同病理分组中的差异有统计学意义(P＜0.05),HPV的阳性率在不同病理分组中的差异也有统计学意义(P＜0.05),恶性程度越高差异越显著(P＜0.01)；宫颈癌组TERC基因异常表达阳性率是100％,HPV为91.7％.结论 TERC基因异常表达与宫颈癌的发生发展及HPV感染密切相关.TERC基因和HPV联合检测,有助于提高宫颈癌的早期诊断有重要价值.
-
消痰散结方对裸鼠人胃癌MKN-45端粒酶活性表达的影响
目的 通过观察消痰散结方对裸鼠人胃癌MKN-45原位移植模型端粒酶活性表达的影响,探讨其抑制胃癌细胞增殖的作用机制.方法 采用OB胶粘贴法建立裸鼠人胃癌MKN-45原位移植瘤模型,随机分成模型组、消痰散结方低、中、高剂量组、5-氟脲嘧啶(5-Fu),每组8只,运用PCR-ELISA方法检测端粒酶活性的表达.结果 ①消痰散结方低、中、高剂量组的平均瘤重与模型组相比,差异有统计学意义(P<0.01);②消痰散结方中剂量组和5-Fu组端粒酶活性与模型组组比较明显降低,差异有统计学意义,P<0.05,消痰散结高剂量组端粒酶活性与模型组组比较差异有统计学意义(P<0.01).结论 消痰散结方抑制胃癌细胞生长,部分可能与其抑制端粒酶活性有关.
