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hTERT启动子的克隆及其在端粒酶阳性肺癌细胞中的靶向转录活性研究
目的克隆人端粒酶催化亚单位(hTERT)启动子序列片段,并探讨hTERT启动子在肿瘤细胞中的靶向转录活性.方法用PCR方法克隆293细胞DNA hTERT 5'端上游旁侧序列长约1.1 kb的启动子片段,经测序无误后将其克隆入荧光素酶报告质粒pGL3-Basic的荧光素酶基因上游,构建pGL3-hTERTp重组质粒,瞬时转染肺癌细胞A549、SPC-A-1、LTEPα-2、NCI-H446、YTMLC-9、GLC-82、95D、A2以及正常成纤维细胞MRC-5,检测荧光素酶活性.并用RT-PCR和TRAP -ELISA方法分析各细胞hTERT mRNA的表达及其端粒酶活性.结果琼脂糖电泳显示PCR克隆的hTERT启动子片段长约1.1 kb,DNA测序结果与GenBank中hTERT启动子DNA序列完全一致,位于hTERT基因转录起始位点上游1126 bp (-1126～-40),片段长度为1084 bp;采用双酶切和PCR两种方法鉴定pGL3-hTERTp重组质粒,均显示构建成功;hTERT mRNA和端粒酶活性在肺癌细胞中呈不同水平的表达,而正常细胞则均为阴性;瞬时转染及荧光素酶活性检测实验显示,hTERT启动子片段在所有检测的肺癌细胞中均有高低不同的转录活性, 在正常细胞MRC-5无转录活性.结论克隆的1084 bp大小的hTERT启动子片段在hTERTmRNA和端粒酶阳性的肺癌细胞中有特异性的转录活性, hTERT启动子可能作为靶向性基因治疗的调控元件.
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修饰hTERT核心启动子靶向转录FCY1的重组腺病毒的构建及鉴定
目的: 构建并鉴定雌激素反应元件与缺氧反应元件共修饰人端粒酶逆转录酶(hTERT)核心启动子靶向转录酵母胞嘧啶脱氨酶(FCY1)的复制缺陷型重组腺病毒.方法: 构建由雌激素反应元件(ERE)和缺氧反应元件(HRE)串联重复序列共修饰的hTERT核心启动子,将该启动子序列与酵母胞嘧啶脱氨酶(FCY1)基因插入穿梭质粒,用穿梭质粒与辅助质粒共转染HEK 293细胞,获得重组腺病毒载体Ad-EHhT-FCY1,经 PCR鉴定证实后,采用终点稀释试验测定病毒滴度. 结果: 经24HRE与8ERE共修饰的hTERT核心启动子序列经正反向测序均正确;穿梭质粒和辅助质粒共转染的HEK 293细胞,在转染后7～10 d出现了典型的细胞病变反应(CPE), PCR反应能扩增出122bp的目的片段,终点稀释试验测定得到的病毒滴度为6.2×107 pfu*mL-1. 结论: 成功构建并获得高滴度的ERE与HRE串联重复序列共修饰的hTERT核心启动子引导FCY1转录的复制缺陷型重组腺病毒.
