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U6/H1双启动子siRNA表达框架构建及其对肿瘤细胞端粒酶活性的干扰作用
目的:构建针对端粒酶hTERT基因的U6/H1双启动子siRNA表达框架(SEC),并观察其转录产物对HeLa细胞端粒酶活性的干扰作用.方法:利用融合PCR技术,针对人端粒酶hTERT基因开放阅读区构建3条U6/H1双启动子SEC以及针对其3'端非翻译区构建1条U6/H1双启动子SEC,对各SEC鉴定后,分别转染人宫颈癌HeLa细胞,用端粒重复序列扩增法(TRAP)检测HeLa细胞的端粒酶活性.结果:4种针对端粒酶hTERT基因的U6/H1双启动子SEC均成功构建,转染HeLa细胞后,对端粒酶活性的抑制率分别为36.8％、57.39％、80.47％、70.31％.结论:针对端粒酶hTERT基因的U6/H1双启动子SEC的成功构建,为开展肿瘤端粒酶基因干扰的实验研究提供了新的有效手段.
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靶向hTERT人工miRNA表达框架的构建及其对HepG2细胞端粒酶活性的抑制作用
目的:构建针对hTERT基因的人工miRNA表达框架,并验证其对HepG2细胞端粒酶活性的抑制作用.方法:应用融合PCR技术针对不同位点设计并构建3个靶向hTERT的人工miRNA表达框架,对各表达框架鉴定后,将其单独或两种共转染HepG2细胞,采用TRAP-银染法和TRAP-二聚体蝎形探针荧光定量PCR法检测细胞端粒酶活性.结果:3个针对hTERT基因的人工miRNA表达框架均成功构建,单独或共转染HepG2细胞后,HepG2细胞的端粒酶活性均被不同程度的抑制,且两种表达框架共转染的抑制作用明显大于单独转染,差异均有统计学意义(均P＜0.05).结论:靶向hTERT基因的人工miRNA表达框架能有效而特异抑制HepG2细胞端粒酶活性,多位点联合抑制是一种有效的实验方案.
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肿瘤靶向性人可溶性TRAIL载体的构建及其在鼻咽癌细胞株CNE-2的表达
目的 克隆人可溶性TRAIL(sTRAIL)基因并构建肿瘤细胞特异性真核表达载体,为鼻咽癌基因治疗的靶向性奠定实验基础.方法 提取人外周血淋巴细胞总RNA,采用RT-PCR扩增含有IL-2信号肽和TRAIL凋亡诱导功能区的融合基因,克隆人真核表达载体pGL3-181hTERT肿瘤特异性端粒酶启动子的下游,构建可分泌表达TRAIL基因的真核表达载体pGL3-181hTERT/TRAIL.用Western blot鉴定鼻咽癌细胞株CNE-2中表达产物.结果 RT-PCR扩增得到了613 bp的cDNA片断.经酶切及测序鉴定,与GenBank中报道的IL-2信号肽和TRAIL凋亡诱导功能区cDNA序列完全一致,成功构建了肿瘤特异性高效分泌表达可溶性人TRAIL的重组真核表达载体pGL3-181hTERT/TRAIL.Western blot结果 显示,获得的瞬时转染TRAIL在鼻咽癌CNE-2肿瘤细胞中能有效表达.结论 重组真核表达载体pGL3/TRAIL的成功构建,为鼻咽癌基因治疗的靶向性提供了可能性.
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评估TCT、HPV、c-MYC、hTERC基因联合检测在宫颈癌筛查中的应用价值
目的 评估液基细胞学检验(TCT)、人乳头状瘤病毒(HPV)、c-MYC、人染色体端粒酶RNA基因(hTERC)联合检测在宫颈癌筛查中的应用价值.方法 将本院妇科门诊接受检查的230例有性生活史的女性作为研究对象,分别进行TCT、HPV检测,并利用荧光原位杂交(FISH)法检测c-MYC、hTERC基因扩增情况,以病理组织学结果为金标准,分别比较四者单独及联合检测时对宫颈上皮内瘤变(CIN)Ⅱ/Ⅲ级及鳞状细胞癌(SCC)的敏感度、特异度、准确性.结果 230例筛查者中,TCT检测阳性124例,HPV阳性155例,c-MYC基因扩增118例,hTERC基因扩增128例.当TCT、HPV、c-MYC、hTERC单独使用时,HPV的敏感度高(84.5％),c-MYC的特异度高(97.6％);hTERC的准确性高(85.2％).当两两组合时,TCT+ HPV与HPV+ hTERC的敏感度高(均为89.2％),TCT+ hTERC的特异度高(87.8％),c-MYC+ hTERC的准确性高(86.5％).当三种指标任意配合使用时,TCT+ HPV+ hTERC的敏感度及准确性高(98.6％、90.9％),TCT+ c-MYC+hTERC的特异度高(79.3％).而四种指标联合使用时,敏感度为98.6％,特异度为72.0％,准确性为89.1％.结论 联合检查能提高宫颈病变筛查的敏感度和准确性,其中TCT+ HPV+ hTERC三者联合检查时诊断效率佳,c-MYC基因检测具有高的特异度.
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碘染色联合p53、Survivin及端粒酶检测对早期食管癌及癌前病变的诊断价值
目的 探讨内镜下碘染色联合组织p53、Survivin及端粒酶检测对早期食管癌及癌前病变的诊断价值.方法 本院因上消化道症状接受胃镜检查且食管黏膜有可疑病变的门诊及住院患者300例进行卢戈碘液染色.对直径≥5 mm的不染区或淡柒区取活检送病理.用免疫组化方法 对病理组织学检查证实为黏膜不典型增生、早期食管癌及30例正常对照者分别检测p53、Sur-vivin及端粒酶表达情况.结果 碘染色对食管黏膜不典型增生轻、中、重度及早期鳞状细胞癌检出率分别为16.3%、9.7%、3.7%和4.3%.不典型增生及早癌组织中p53蛋白、Survivin及端粒酶表达相关性有统计学意义,并且碘不染色与p53、Survivin及端粒酶阳性表达相关性也有统计学意义(P均<0.01);碘染色联合p53、Survlvin及端粒酶检测对重度不典型增生和早期食管癌诊断的敏感性、特异性和准确率分别达100%、92.3%和91.8%.结论 碘染色联合p53、Survivin及端粒酶检测对诊断早期食管癌及其癌前病变具有重要价值.
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端粒酶活性在消化道息肉组织中的检测及临床意义
目的 探讨端粒酶在消化道息肉中的检测及临床意义.方法 电子内镜下取得胃、肠息肉组织标本5块,3块送活检,另2块进行端粒酶活性检测.结果 增生性息肉、腺瘤、炎性息肉、幼年性息肉和息肉样胃(肠)癌组织的端粒酶阳性率分别为5%、19.5%、15.4%、0%和85.7%;随着息肉直径的增大、数目的 增多,其端粒酶的阳性表达率也逐渐增高.结论 端粒酶活性检测可作为消化道息肉恶变的早期预测指标.
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胃癌及癌前期病变中端粒酶活性及临床意义
该文探讨胃癌及癌前期病变中端粒酶活性及其临床意义.对96例胃癌患者及良性胃病在胃镜下嵌取病变部位胃黏膜5块,3块送活检,另2块则用端粒酶重复扩增法(TRAP)行端粒酶活性检测.结果表明胃癌的端粒酶阳性率为92.5%(37/40),癌前期病变的阳性率为14.2%(8/56) ,癌前病变中端粒酶活性随着胃黏膜发展而升高.认为端粒酶活性检测不仅可作为胃癌的特异性较强的肿瘤标记物,还可作为胃黏膜癌变的早期预测指标.
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hTERT反义寡核苷酸促进紫杉醇诱导Hut78细胞凋亡
目的:探讨转染人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)反义寡核苷酸后能否增强紫杉醇诱导皮肤T细胞淋巴瘤细胞株Hut78凋亡.方法:采用脂质体介导的基因转染技术将hTERT反义寡核苷酸(AODN)、正义寡核苷酸(SODN)导入Hut78细胞株中,应用端粒酶重复序列扩增及酶联免疫吸附方法(TRAP-PCR-ELISA)、逆转录-聚合酶链反应、四甲基偶氮唑蓝法(MTT)、台盼蓝拒染法和流式细胞仪分析测定联合应用紫杉醇后对细胞端粒酶活性、hTERT mRNA表达、细胞增殖及凋亡的影响.结果:转染hTERT基因反义寡核苷酸并联合应用紫杉醇,48 h后Hut78细胞增殖即被明显抑制,端粒酶活性下降,hTERT mRNA表达降低,分别同SODN联合紫杉醇组及单用紫杉醇组进行比较,有显著差异(P＜0.05);MTT结果显示,紫杉醇对AODN组、SODN组及空白对照组细胞的IC50值分别为(81.10±1.68)nmol/L,(138.70±1.80)nmol/L和(139.40±5.50)nmol/L,差异显著(P＜0.05);经流式细胞仪检测,AODN联合紫杉醇组凋亡率明显高于SODN联合紫杉醇组和单用紫杉醇组.结论:hTERT反义寡核苷酸与紫杉醇有协同抗肿瘤效应,并能增加Hut78细胞对紫杉醇的敏感性,促进紫杉醇诱导Hut78细胞凋亡.
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三氧化二砷诱导Raji细胞凋亡过程中端粒酶活性和hTERT、bcl - 2基因表达的研究
目的:研究三氧化二砷(As2O3)诱导Raji细胞凋亡并初步探讨端粒酶活性、人类端粒酶逆转录酶(hTERT)基因及bcl-2基因表达之间的关系.方法:通过姬姆萨染色来观察细胞的凋亡;以RT-PCR分析bcl-2、hTERT基因的mRNA表达水平;利用半定量多聚酶链反应-酶联免疫反应(PCR-ELISA)方法检测As2O3处理Raji细胞前后端粒酶活性的改变.结果:2μmol/L As2O3能诱导Raji细胞凋亡,2μmol/L As2O3作用于Raji细胞8 h、12 h、24h hTERTmRNA相对表达量分别与对照组比较有显著差异(P＜0.05),12 h、24h bcl-2mRNA相对表达量分别与对照组比较有显著差异.2μmol/LAs2O3作用48 h后,Raji细胞中端粒酶活性即出现下降,作用72 h、96h,端粒酶的活性明显受到抑制,吸光度分别为0.829、0.328、0.291,分别与空白对照组比较有显著差异(P＜0.05).结论:As2O3诱导Raji细胞凋亡过程中,端粒酶活性下调与hTERT、bcl-2基因mRNA表达下降有关.
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细胞凋亡的DNA缺口原位检测法
与细胞增殖、分化一样,细胞凋亡在胚胎发育、造血、免疫调节及肿瘤发生等方面发挥重要的作用.为使细胞凋亡的检测既简便易行,又直观可靠,我们参考有关文献[1],改良了一种DNA缺口的末端转移酶原位检测法.
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常规检查淋巴结阴性No.7组胃癌患者的淋巴结微转移研究
目的探讨常规病理检查无淋巴结转移的胃癌淋巴结微转移的特点,并分析微转移与各种临床病理因素的关系.方法应用淋巴结组织连续切片和端粒酶 RT-PCR ELISA方法检测 46例胃癌患者常规病理检查无淋巴结转移的 No.7组淋巴结 138个,并结合胃癌患者的临床病理资料进行统计学分析.结果本组 13例(28.3%) 32枚淋巴结(23.2%)经连续切片检出有微转移;而端粒酶阳性表达为 20例(43.5%) 49枚淋巴结(35.5%).端粒酶 RT-PCR ELISA检测敏感性为 100%,特异性为 84%,阳性预测值为 65%,阴性预测值为 100%,诊断准确率为 88%.淋巴结微转移与患者年龄、性别、原发肿瘤部位、组织学类型和转移淋巴结分型无关(P >0.05),但与原发肿瘤大体类型、大小及是否浸透浆膜有关(P< 0.05).结论对常规病理检查无淋巴结转移的胃癌患者,为客观评价胃癌临床病理分期及其预后,有必要监测其微转移,端粒酶 RT-PCR ELISA方法可以作为传统组织学检查方法的补充.
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逆转录酶抑制剂AZT对胶质瘤干细胞端粒酶活性和细胞增殖的影响
目的 探讨逆转录酶抑制剂3-叠氮-3-脱氧胸腺核苷(AZT)对脑胶质瘤干细胞增殖的影响及相关机制.方法 原代分离培养脑胶质瘤干细胞和脑胶质瘤细胞并鉴定,两种细胞同时设立为实验组(0.125 mot/L、0.250 mol/L、0.500 mol/L AZT)和对照组.MTT法检测AZT对两种细胞增殖的影响;流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期的改变;端粒重复序列扩增技术-酶联免疫吸附试验(TRAP-ELISA)检测端粒酶活性的变化.结果 AZT对两组细胞的生长抑制呈浓度-时间依赖性(均P<0.05),在同一浓度和时间点,AZT对脑胶质瘤干细胞的生长抑制作用弱于脑胶质瘤细胞(均P<0.05).0.250 mol/L、0.500 mol/L AZT作用72 h后,脑胶质瘤干细胞的凋亡率分别为(4.21±1.53)%、(10.60±0.38)%,而脑胶质瘤细胞的凋亡率分别为(6.75±1.25)%,(14.30±2,59)%,明显高于胶质瘤干细胞(均P<0.05).AZT对两组细胞端粒酶活性的抑制呈浓度-时间依赖性(均P<0.05),且在同一浓度和时间点对脑胶质瘤细胞的作用明显强于脑胶质瘤干细胞(均P<0.05).结论 逆转录酶抑制剂AZT对脑胶质瘤干细胞和脑胶质瘤细胞均有明显的生长抑制作用,可能机制是通过抑制端粒酶活性、调控细胞周期和诱导细胞凋亡实现.脑胶质瘤干细胞的耐药性强于胶质瘤细胞,其机制有待进一步研究.
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永生化人骨髓基质细胞的表面抗原及多向分化研究
目的 研究本所转入人端粒酶逆转录酶基因的人骨髓基质细胞(Hmsc-TERT细胞)的生物学特性.方法 复苏Hmsc-TERT细胞第30代,扩增,流式细胞仪检测细胞表面抗原;进行体外脂肪细胞、成骨细胞定向诱导,并分别进行油红O染色、碱性磷酸酶染色及von Kossa染色.结果 Hmsc-TERT细胞表面抗原检测CD34、CD45、CD44、CD106、CD166均为阴性;脂肪细胞定向诱导后油红O染色见胞浆内有红色脂肪颗粒,成骨细胞定向诱导后见胞浆内有碱性磷酸酶染色阳性黑褐色颗粒,vonKossa染色见有钙结节形成.结论 Hmsc-TERT细胞依然保留骨髓基质干细胞的自我更新特性及多向分化潜能.
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转导hTERT基因致人骨髓基质细胞永生化及向神经元样细胞诱导分化的研究
目的建立永生化的人骨髓基质细胞(hMSC)系,以供神经外科临床和基础研究使用.方法原代培养人骨髓基质细胞,采用含有人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的逆转录病毒载体上清感染hMSC,经筛选得到阳性克隆,在体外进行连续培养.应用PCR、逆转录PCR(RT-PCR)和免疫细胞化学方法检测hTERT基因的整合及表达情况,并用10%β-巯基乙醇(β-ME)、反式维甲酸(RA)、Forskolin和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对转化后的hMSC-hTERT细胞进行诱导,使其向神经元样细胞分化.结果外源性hTERT基因在DNA、RNA和蛋白质水平均有表达,诱导后的hMSC-hTERT细胞表达神经元特异性标志物神经核蛋白(NeuN)和βⅢ微管蛋白(Tubulin-βⅢ).hMSC-hTERT细胞至今已传至82代.结论外源hTERT基因在hMSC细胞中稳定整合并表达,永生化的hMSC细胞系成功建立:在一定诱导条件下,永生化的hMSC细胞能够在体外分化成神经元样细胞.
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人神经干细胞端粒酶活性检测
目的检测体外培养的人神经干细胞端粒酶活性,分析其与神经干细胞生物学特性的关系.方法分离、鉴定并扩增取自10～14周药物流产胎儿大脑皮质的神经干细胞,应用PCR-ELISA法检测神经干细胞端粒酶活性.结果经免疫组化检查,培养的细胞为人神经干细胞;其在体外培养过程中,仅在早期10代表达极低的端粒酶活性(相对活性为6.4%～21.2%),其后消失.结论神经干细胞表达端粒酶活性,但较低且不能长期维持,这可能是神经干细胞不能长期传代的原因之一.
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端粒酶反转录酶在体外培养的内皮祖细胞中的表达
目的 探讨体外培养的大鼠内皮祖细胞增殖活性与端粒酶反转录酶表达的关系.方法 原代培养大鼠骨髓源性内皮祖细胞.在培养7、14、21和28 d时,用MTT法检测内皮祖细胞在不同时间点的增殖活性;流式细胞术检测内皮祖细胞早期凋亡率;免疫细胞化学方法、RT-PCR和Western印迹技术检测内皮祖细胞端粒酶反转录酶mRNA和蛋白表达的变化.结果 大鼠骨髓单个核细胞可以被诱导成内皮祖细胞.内皮祖细胞增殖活性随着培养时间的延长呈现单峰曲线,在培养14 d时增殖活性高(P＜0.01).内皮祖细胞凋亡率随培养时间的延长而增加,在培养7 d、14 d、21 d和28 d时分别为0.28%、0.66%、1.38%、1.52%;衰老率分别为3.04%、20.28%、24.36%、16.52%,14 d内皮祖细胞衰老率显著增加(P＜0.01),21 d衰老率高,但二者之间差异无统计学意义.端粒酶反转录酶mRNA和蛋白表达呈单峰曲线,在培养14 d时表达高,以后表达随培养时间的延长逐渐降低(P＜0.05).结论 大鼠骨髓内皮祖细胞增殖活性下降可能与端粒酶反转录酶活性下降有关.
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转录因子Sp1和Sp3对Jurkat T细胞端粒酶活性的调节作用
目的探讨转录因子Sp1、Sp3对JurkatT细胞端粒酶活性和端粒酶逆转录酶(hTERT)的调节作用.方法用脂质体将Sp1、Sp3表达载体转入Jurkat T细胞,用Westem blotting方法检测蛋白表达水平;用端粒酶PCR-ELSA法检测细胞端粒酶活性并用银染显示端粒酶活性梯度;用RT-PCR方法检测hTERTmRNA水平.结果Sp1、Sp3载体转化36 h的细胞Sp1、Sp3蛋白水平分别升高59.6%(P〈0.01)和36.8%(P〈0.05);随着Sp1表达水平的增加,端粒酶活性和hTERT mRNA水平明显增加,增加率分别为38.5%(P〈0.05)和25.4%(P〈0.05).而Sp3表达载体对端粒酶活性和hTERT mRNA水平无明显影响.结论转录因子Sp1通过调节hTERT mRNA转录水平而调节Jurkat T细胞端粒酶活性,Sp3无此作用.
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人端粒酶RNA反义寡核苷酸对顺铂诱导K562细胞凋亡的影响
目的研究人端粒酶RNA(hTR)反义寡核苷酸(ASODN)可否增强K562细胞对顺铂的敏感性.方法采用与hTR模板区互补的硫代ASODN处理K562细胞,用端粒酶重复扩增分析-PCR-ELISA检测法观察端粒酶活性的变化;琼脂糖凝胶电泳分析细胞凋亡的DNA断裂:AnnexinV+PI双染后流式细胞仪检测凋亡细胞百分率.结果经ASODN作用后,K562细胞端粒酶活性明显下降.ASODN作用K562细胞24 h,再加入顺铂作用72 h,琼脂糖凝胶电泳可见DNA梯形条带,而正义寡核苷酸(SODN)与顺铂联合作用组及单用顺铂组均未见到明显的DNA梯形条带.ASODN作用K562细胞24 h,再加入5 μmo1/L顺铂作用48、72 h的凋亡细胞百分率(18.3%和31.6%)分别与SODN联合顺铂作用组(9.6%和10.5%)、单用顺铂组(7.1%和9.4%)比较,差异有显著性(P<0.01).结论以hTR模板区为靶点,ASODN能抑制端粒酶活性并促进顺铂诱导K562细胞的凋亡.
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端粒重复序列扩增法结合微孔板杂交法定量检测端粒酶活性
目的探讨定量检测端粒酶活性的非放射性检测方法.方法将端粒重复序列扩增测定法(TRAP)与微孔板杂交相结合建立了非放射性检测方法,对3例正常肝组织和4例肝癌患者治疗前后的肝癌组织、瘤旁组织、肝癌凋亡组织进行检测.结果肝癌组织具有比较高的端粒酶活性,而正常肝组织和瘤旁组织无此酶活性,肝癌凋亡组织端粒酶活性显著降低.结论该定量分析方法简单、灵敏、特异性强,可以比较准确地反映组织的端粒酶活性状态.
关键词： 端粒重复序列扩增测定法 微孔板杂交 端粒 末端转移酶 肝肿瘤 -
甲状腺病变端粒酶活性检测及其意义
目的:研究端粒酶在甲状腺良恶性病变中的活性状态,探讨端粒酶活性检测在甲状腺病变定性诊断中的价值.方法:采用TRAP-PCR-ELISA对116份甲状腺组织进行端粒酶活性分析.结果:27例甲状腺癌中25例表达端粒酶活性,阳性率为92.6%,22例癌旁组织仅1例阳性,阳性率为4.5%;23例甲状腺腺瘤亦仅1例阳性,阳性率为4.3%;26例结节性甲状腺肿中1例阳性,阳性率为3.8%;正常甲状腺组织未检测出端粒酶活性.甲状腺癌组织端粒酶活性阳性率较其他几种组织差异有非常显著性(P＜0.01).结论:端粒酶是甲状腺癌的定性标志物,在甲状腺病变的鉴别诊断中具有重要价值.对临床常见的甲状腺结节可开展细针抽吸标本端粒酶活性分析,指导临床治疗.
