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CAR-T免疫治疗在血液肿瘤治疗中的研究现状和挑战
嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)T细胞治疗技术经过近30年的发展,逐渐成为治疗血液肿瘤的新趋势.随着基因工程技术的不断发展,CAR-T技术已经经历了4代革新.CAR-T结构从单一信号分子发展到2个及2个以上共刺激分子,再到编码CAR基因或启动子,CAR-T技术发展不断成熟.CAR-T能特异识别肿瘤抗原,不受主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)限制性的影响,在治疗血液肿瘤领域取得了突破性的成果.本文就CAR-T的历史、结构和作用机理、以及在急性淋巴细胞白血病、急性髓系白血病、慢性髓系白血病、多发性骨髓瘤等血液肿瘤临床治疗中的研究现状和面临的挑战作一综述.
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应用CD19修饰的嵌合抗原受体T细胞治疗淋巴细胞白血病
应用嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptorT cell,CAR T)治疗急性和慢性淋巴细胞白血病,在近期已取得了新进展.CAR T细胞是通过将T细胞受体基因和抗CD19抗体基因嵌合,转柒至T细胞,在体外扩增以后输注给患者来治疗白血病的新型免疫治疗.经过基因改造后的CAR T细胞的表面具有特异性位点,可以识别淋巴细胞白血病中B细胞表面的CD19抗原.CD19抗原的持续刺激可使CAR T细胞不断增殖与活化,CAR T在患者体内可以增殖1000倍,有效杀伤急性和慢性淋巴细胞白血病细胞.本文就CAR T细胞及其对急性和慢性淋巴细胞白血病的疗效进行综述.
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血液系统恶性肿瘤多肽类疫苗的研究进展
近年来血液系统恶性肿瘤的治疗有了显著进展,但由于微小残留病灶(MRD)的存在,复发仍是亟待解决的主要问题.肿瘤多肽疫苗是有望克服MRD的免疫疗法之一.本文重点介绍血液系统恶性肿瘤中WT1、RHAMM、BCR-ABL、PR1多肽疫苗的新临床试验结果,PRAME、Survivin等多肽的特异性免疫反应新进展,及不规则肽疫苗、新型免疫佐剂、结合肽疫苗、Ad-tWT1疫苗等增强疫苗免疫治疗效应的新措施及其应用前景.
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嵌合抗原受体T细胞应用进展
随着越来越多的有关嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)T细胞的临床试验成功开展,应用嵌合抗原受体制备的肿瘤特异性T淋巴细胞开始逐渐进入人们的视野.嵌合抗原受体T细胞免疫治疗是近年来迅速发展的肿瘤过继免疫治疗方法.该技术近年来无论在血液系统恶性肿瘤还是在实体瘤领域都取得了巨大的突破,但CAR-T技术在不断前进的道路上仍然面临着诸多困难.本文针对CAR-T细胞的临床应用情况、目前面临的挑战及发展趋势等作一综述.
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调节性T细胞体外扩增和免疫治疗研究进展
CD4+ CD25+调节性T细胞(Treg)在建立和维持免疫耐受方面发挥重要作用.若干实验模型已证明它可以控制自身免疫性疾病,维持同种异体移植耐受并预防过敏性疾病.限制其临床应用的原因与它明确的细胞表型和外周血中有限的数量有关,即占CI4+T细胞的百分比不超过5％-10％.近年来,利用多色流式细胞仪和免疫吸收柱技术的Treg分选方法提供了克服这些障碍的途径,并开启了Treg临床应用的大门.本综述突出Treg的特点,描述细胞分选和体外扩增技术的当前信息,并概述近几年开展的过继转移实验和免疫治疗临床试验.可以预见,Treg的过继转移将会称为一种很有前途的免疫抑制治疗.
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嵌合抗原受体技术免疫治疗血液系统恶性肿瘤的研究进展
嵌合抗原受体(CAR)是单链抗体的可变区和T细胞信号分子的融合蛋白,它使T细胞可以通过非MHC限制性的方式识别特异性抗原,发挥杀伤作用.目前,CAR的信号域已从第一代的单一信号分子发展为包含CD28、4-1BB等共刺激分子的多信号结构域(第二、三代),在体内的存在时间及杀伤能力明显增强.利用靶向CD19和CD20的CAR修饰的T细胞进行过继输注,治疗血液系统恶性肿瘤是目前临床研究的热点.临床试验表明第二代CAR的抗肿瘤能力较第一代CAR明显增强,对于复发及难治性B系肿瘤有一定的疗效.同时,CAR技术也正研究用于骨髓移植后的过继免疫治疗等领域.在治疗安全性方面,目前临床试验中大部分患者对CAR治疗耐受性良好,但学者们对CAR可能引起插入突变、脱靶效应和炎症反应等不良反应也不无忧虑.本文就CAR技术在血液系统恶性肿瘤免疫治疗中的应用及安全性评价作一综述.
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树突状细胞疫苗治疗多发性骨髓瘤的研究进展
近年来多发性骨髓瘤的发病率不断上升,但目前对于多发性骨髓瘤仍然没有很好的治疗方法.树突状细胞是一类抗原呈递细胞,具有启动和调控免疫反应的能力.利用肿瘤抗原冲击树突状细胞的免疫治疗策略已被证明是安全的并且对许多肿瘤具有一定的治疗效果.本文综述了多发性骨髓瘤相关的各种肿瘤抗原类型及树突状细胞免疫治疗多发性骨髓瘤的临床实验,并且分析了树突状细胞免疫治疗在未来实验研究方面的前景.
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癌-睾丸抗原在多发性骨髓瘤中研究进展
癌-睾丸抗原(cancer-testis antigens,CTA)是一组肿瘤相关抗原,主要定位于X染色体,限制性表达在正常的睾丸、卵巢、胎盘等免疫豁免组织,在其他正常组织中不表达或低表达,而在各种肿瘤组织中异常表达.CTA相关蛋白具有免疫原性,可以被表观遗传学药物所调控,是肿瘤免疫治疗的有效靶点.多发性骨髓瘤(multiple my-eloma,MM)难以被治愈,其临床复发率高.有研究证实,多发性骨髓瘤细胞系及原代细胞均表达CTA,并提示其与预后相关.现就CTA在MM免疫治疗中的研究现状作一综述,为多发性骨髓瘤的临床治疗提供新的思路.
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细胞免疫治疗白血病研究进展
尽管化疗能诱导恶性血液病缓解,但是缓解后存在复发风险且化疗毒性无法避免.研究人员一直致力于通过免疫手段清除肿瘤细胞.近年来,人们发现了许多白血病相关抗原(LAA)能被细胞毒性T细胞(CTL)所识别,同时具有HLA-Ⅰ限制性.这些LAA包括WT1、PR-3、RHAMM、BCR-ABL和Aur-A等.在实验室研究基础上,目前开展的恶性血液病免疫治疗手段包括有肿瘤多肽疫苗、获得性T细胞治疗、NK细胞及DC-CIK治疗等.本文就细胞免疫治疗白血病研究进展作一综述.
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GITRL联合IL-21基因真核表达载体的构建及体外研究
本研究构建人糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体配体(GITRL)联合白介素-21(IL-21)基因真核表达载体,为探讨目的基因对慢性髓系白血病(CML)来源树突状细胞(DC)的影响.应用脂质体介导法将重组真核表达载体转染至纯化的DC,而此纯化的DC来源于经伊马替尼治疗有效或无效的慢性期CML患者或健康志愿者.应用ELISA法检测转染后DC细胞因子的浓度变化.将转染后的DC与纯化的自体NK混合培养使之成为DC-CIK.以DC-CIK细胞为效应细胞,应用乳酸脱氢酶释放法观察其对靶细胞的杀伤率.结果表明:所获目的基因经测序 与GenBank比对序列一致,PCR及限制性核酸内切酶检测显示,真核表达载体质粒经限制性酶切鉴定片段大小正确,并均可转染至伊马替尼治疗有效、无效的慢性期CML患者及健康志愿者来源的DC细胞.成功转染相应载体后的DC分别表现出IL-2和IFN-γ分泌量增加;细胞毒活性试验表明,转染后的DC可增加自体NK细胞对K562细胞的杀伤活性.结论:DC能够通过转染IL-21和GITRL基因的方式获得自我活化、上调自身细胞因子分泌的能力,为酪氨酸激酶抑制剂治疗无效的CML患者的免疫治疗奠定了理论依据和实验基础.
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1186例HLA基因与白血病相关性分析研究
本研究探讨HLA-A、B、DRB1基因与3种常见白血病的相关性,采用序列特异性引物聚合酶链反应(polymerase chain reaction with sequence-specific primers,PCR-SSP)技术,对1186例的白血病患者(ALL 326例、AML 545例、CML 315例)进行HLA分型,与1234份健康非亲缘供者进行显著性比较,用Bonferroni校正法进行校正.结果表明:ALL患者组与对照组相比,HLA-DRB1* 09的等位基因频率显著低于对照组(10.87％ vs 16.08％; Pc=0.014,OR=0.637,95％ CI =0.487-0.834);CML患者组与对照组相比,HLA-B* 18的等位基因频率显著高于对照组(1.28％ vs 0.20％;Pc=0.039,OR=6.336,95％ CI =2.066-19.434).某些HLA分子和白血病之间可能存在正相关和负相关.HLA-DRB1* 09和ALL呈负相关表明,DRR1*09通过限制T细胞免疫反应在早期白血病性事件中起着重要作用;而HLA-B* 18和CML呈正相关,提示B*18分子可能不主动呈递特异性白血病抗原,导致免疫逃逸.结论:本研究为临床对白血病的免疫治疗提供一些线索和思路.
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DC与CIK共培养对肝癌细胞杀伤活性的研究
本研究的目的是观察细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)与同源树突状细胞(DC)共培养后DC-CIK细胞的增殖活性、表型的变化,及其对肝癌细胞细胞毒作用的影响.采集健康供者的外周血单个核细胞(MNC),置于37℃,5%CO2培养箱培养2小时,收集非贴壁细胞用于诱导培养CIK细胞,贴壁细胞诱导分化出成熟DC,将成熟DC和CIK细胞按1:5的比例混合培养3天,用MTT法检测DC-CIK共培养细胞杀伤SMMC-7721肝癌细胞株的活性.结果显示:DC与CIK细胞共培养后,DC-CIK细胞群的增殖活性和杀伤活性较单纯的CIK细胞更高.结论:DC与CIK共培养细胞是一种增殖活性和细胞毒活性均高于CIK细胞的免疫活性细胞.
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特异诱导脐血CD8+抗白血病细胞毒淋巴细胞的研究
微小残留病灶(minimal residual disease,MRD)的存在是导致白血病复发的主要根源,特异性免疫治疗能有效地清除MRD,其中的策略之一就是诱导并回输白血病特异性的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL).本实验的目的是研究脐血能否在体外诱导生成CD8+ CTL,所生成的CD8+ CTL能否特异性杀伤白血病细胞,从而确定脐血淋巴细胞的利用价值及用于特异性免疫治疗的可行性.通过联合细胞因子体外诱导脐血单个核细胞(mononuclear cells,MNC)分化为树突状细胞(dendritic cells,DC),同时负载U937冻融抗原;成熟DC刺激同源的脐血T淋巴细胞成为CTL,经MACS磁珠分选出CD8+ CTL.用倒置显微镜、扫描电镜及流式细胞仪等方法检测DC,四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法测定杀伤活性.结果显示,10份人脐血标本均可培养出形态典型、功能成熟的DC.3组效应细胞CD8+ CTL、CD8- CTL和T淋巴细胞(TL)组在相同效靶比(40∶1)对U937细胞株的杀伤率分别为(66.36±12.43)%、(34.47±8.19)%和(15.79±4.64)%,以CD8+ CTL组高;效靶比为40∶1时,CD8+ CTL对U937细胞株的杀伤率(66.36%)高于对K562细胞株的杀伤率(41.97%)(P＜0.05);而CD8- CTL对U937细胞株和K562细胞株的杀伤率无显著差异(P＞0.05).结论:用负载U937白血病细胞株抗原的成熟脐血DC可使脐血淋巴细胞诱导产生特异性的CD8+ CTL;CD8+ CTL对U937白血病细胞株的杀伤活性强于CD8- CTL的作用;CD8+ CTL对U937白血病细胞株杀伤具有特异性.
关键词： CD8+细胞毒性T淋巴细胞 免疫治疗 白血病 脐血 树突状细胞 -
用携有存活蛋白基因的重组腺病毒载体转染树突状细胞诱导细胞毒T细胞抗淋巴瘤免疫效应
本研究探讨转染survivin(SVV)基因的树突状细胞(DC)体外诱导特异性抗淋巴瘤的免疫效应.对人外周血DC进行诱导培养,以Ad-SVV转染DC,用Western blot鉴定Survivin的表达,用乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应,用混合淋巴细胞反应(MLR)测定DC刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力,以ELISA法检测上清中的细胞因子IL-12含量.结果表明:在MLR中,刺激应答比(S/R)为1:5、1:10、1:50和1:100时,转染Ad-SVV的DC有较强刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力;转染Ad-SVV的DC组所诱发的CTL活性明显高于对照DC组;转染病毒后第2天,转染Ad-SVV的DC组的IL-12分泌水平高于对照DC组.结论:含存活蛋白基因的DC能够在体外诱导特异性CTL效应,对CA46细胞有明显的杀伤作用.
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负载U266细胞抗原的树突状细胞诱导T细胞的抗骨髓瘤活性
本研究探讨负载骨髓瘤U266细胞裂解物的树突状细胞(DC)瘤苗活化的T细胞对U266细胞的体外杀伤作用.用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞,然后分别用含重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、重组人白细胞介素-4(IL-4)的AIM-V无血清培养液和含胎牛血清的RPMI 1640培养液体外诱导培养DC,用MTT法检测负载U266细胞全抗原的DC活化的T细胞对U266细胞的杀伤作用.结果表明:健康人外周血来源的单个核细胞用无血清培养液和含血清培养液诱导培养均可得到足够数量的DC,这两种培养液培养的DC在表型上无明显差异.分别用负载U266细胞全抗原的DC+IL-2、成熟DC+IL-2和单独应用IL-2刺激后的T细胞与U266细胞共培养,其对U266细胞的杀伤作用逐渐减弱,负载U266细胞全抗原的DC+IL-2刺激后的T细胞较成熟DC+IL-2刺激后的T细胞对U266细胞的杀伤作用明显,且T细胞对U266细胞的杀伤率随效靶比的增加而升高.结论:用GM-CSF、IL-4诱导培养健康人外周血单个核细胞可以得到不成熟的DC,体外负载U266细胞全抗原的DC可以刺激自体T细胞增殖并能杀伤U266细胞.
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白血病肿瘤相关抗原特异性细胞毒T细胞的体外扩增及杀伤功能的实验研究
目的:探索体外扩增白血病肿瘤相关抗原特异性细胞毒T细胞(tumor-associated antigen-specific cytotoxic T lymphocytes,TAA-CTL)的可行性,并验证其特异性杀伤作用.方法:采用密度梯度离心法分离出健康志愿者外周血单个核细胞,诱导培养树突状细胞(dendritic cells,DC)并负载白血病相关抗原WT1、PRAME、NY-ESO-1混合多肽,然后与自体T淋巴细胞共培育,扩增出TAA-CTL.用流式细胞术检测TAA-CTL表型及多种细胞因子的分泌率,细胞毒实验检测TAA-CTL对负载肿瘤相关抗原的自体靶细胞的杀伤力.结果:①体外诱导培养的TAA-CTL扩增倍数为3.81±1.61;流式细胞术检测其中CD3+细胞平均为(97.22±0.71)％,CD3+ CD4+占(41.47±27.08)％,CD3+ CD8+占(56.40±11.15)％,CD3-CD56+占(0.50±0.31)％,CD19+仅占(0.14±0.20)％,与对照组细胞表型分析比较差异无统计学意义(P＞0.05).②流式细胞术检测经抗原刺激后TAA-CTL分泌的胞内细胞因子,CD8+ TAA-CTL分泌的IFN-γ和TNF-α水平分别为(27.67±2.21)％和(34.2±0.71)％,CD4+ TAA-CTL分泌的IFN-γ和TNF-α分别为(21.6±2.55)％和(9.97±3.44)％;对照组CD8+ CTL分泌的IFN-γ和TNF-α水平分别为(1.36±0.04)％和(5.58±0.03)％,CD4+ CTL分泌的IFN-γ和TNF-α分别为(0.91±0.06)％和(1.60±0.07)％,均明显低于TAA-CTL组,其差异有统计学意义(P＜0.01).TAA-CTL在效靶比为5∶1、10∶1、20∶1和40∶1时对负载TAA的自体靶细胞的杀伤率分别为(26.85±5.25)％、(60.55±2.45)％、(67.4±3.60)％和(77.00±1.00)％,对未负载TAA的自体靶细胞未见明显杀伤作用(P＜0.05).结论:来源于健康志愿者的外周血单个核细胞体外可以成功诱导扩增出TAA-CTL并具有特异性杀伤功能.
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转染mFas配体的COS-7细胞诱导Fas+淋巴瘤细胞系(Yac-1)凋亡
本研究探讨通过Fas配体(Fasligand,FasL)-Fas途径进行免疫治疗淋巴瘤的可能性.常规转化pBillneo-mFasL至大肠杆菌DH5α,经扩增、质粒抽提和纯化后,进行限制性内切酶酶切、mFasL基因PCR及其产物DNA测序,以鉴定pBillneo-mFasL内mFasL基因一级结构及插入方向;用脂质体法转染pBillneo-mFasL至猴肾COS-7细胞,G418选择培养后,Western印迹分析外源性mFasL cDNA基因表达水平,将高表达mFasL的COS-7细胞与Fas+小鼠淋巴瘤细胞系Yac-1以不同比例混合培养,5J时后收集悬浮的Yac-1细胞,用膜联蛋白(annexin)V/PI标记后,借助FCM观察细胞凋亡率.结果表明,质粒pBillneo-mFasL的EcoRI酶切获得920bp和7 227bp产物,HomdⅢ酶切获得1 293bp和6 807bp产物,初步证实插入mFasL cDNA片段与理论预计大小一致,并系正向插入;PCR扩增出自起始密码子(ATG)至终止密码子(TAA)后+36bp的mFasL cDNA全长890bp序列,DNA测序结果与基因库已知序列完全一致;pBillneo-mFasL转染COS-7细胞,并经G418选择培养后,Western印迹检测到明显mFasL蛋白质表达;当用这种高表达mFasL蛋白质的COS-7细胞与Fas+Yac-1细胞以1:1,5:1和10:1混合培养5 小时后,用annexin V/PI标记悬浮Yac-1,结果后者凋亡率分别为(22±4.8)%,(32.18±7.8)%和(51.8±5.4)%,与对照转染空质粒pBillneo的COS-7细胞组存在显著差异(P＜0.01).结论:通过FasL-Fas抗原途径体外具有明显杀伤高表达Fas抗原的淋巴瘤细胞的作用.
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多表位BCR-ABL融合基因的合成、克隆及表达研究
慢性粒细胞白血病(CML)的免疫治疗是清除白血病微小残留病并终根治CML的方向之一,包含BCR-ABL融合区的多肽具有良好的免疫原性,在体内、外可诱发BCR-ABL特异的T细胞克隆.以BCR-ABL融合肽瘤苗激发特异性T细胞应答抗CML免疫治疗有希望成为根治CML残留白血病的有效手段.本实验通过基因工程技术,设计一个280 bp的融合抗原基因片段,包含HLA-A2,HLA-A3,HLA-DR11等3个限制性BCR-ABL抗原表位,以及破伤风类毒素和霍乱毒素B亚单位的外源T细胞刺激表位.该融合抗原基因已在大肠杆菌中获得高效表达,所纯化的融合蛋白具有良好的活性及抗原性,为进一步实验奠定了基础.
关键词： BCR-ABL融合基因 多表位 基因表达 慢性粒细胞白血病 免疫治疗 -
从单核细胞分化的树突状细胞的低温保存及其临床应用
树突状细胞(dendritic cells,DCs)作为专职的抗原递呈细胞,已被广泛地应用于临床的肿瘤疫苗治疗.目前的临床方案大多为分次给病人注射＞10 6个细胞/次,不同批次培养的DCs,连续4-6周.为了提高疗效,简化治疗程序及规范疗程,有必要将DCs低温保存,使患者在治疗过程中得到同批次的培养的DCs.本实验从患者外周血采取单个核细胞,经细胞淘洗分离单核细胞,在800 U/ml GM-CSF+100 ng/ml IL-13的培养条件下,将单核细胞于Teflon疏水袋中诱导产生DCs.将DCs以-1℃梯度降温及不控温两种方式将DCs冻存于-80℃及液氮中.1个月后,42℃快速复温.检测其免疫表型(CD1a,CD14,CD40,CD80,CD83,CD86,CD54,CD58,CD16,CD32,CD64,HLA-DR)及其对自体及异体淋巴细胞的刺激作用.结果表明,2种方式的低温保存及复温过程不改变DCs的免疫表型及对淋巴细胞的刺激功能.结论:应用Teflon袋,能够从外周血单核细胞中诱导出大批量的DCs,这些DCs可被低温保存而不改变其功能,为其l临床应用奠定了基础.
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嵌合抗原受体设计的NK细胞在多发性骨髓瘤中的应用研究
目的:通过建立CAR(CD138-CD28-CD3ζ)-NK细胞,探讨CAR(CD138-CD28-CD3ζ)-NK细胞对多发性骨髓瘤的抗肿瘤作用.方法:把抗CD138scFv-CD28-CD3连接到pcDNA3.1质粒,使用三质粒慢病毒包装系统转染293T细胞,收集病毒后感染NK92MI细胞系,应用嘌呤霉素筛选阳性细胞株;通过RT-PCR及West-ern blot检测CAR在NK92MI细胞系的表达,流式细胞术检测NK92MI细胞分泌细胞因子cd107a的能力.结果:经过基因工程技术,体外构建了CAR基因片段,基因测序验证基因序列正确.通过病毒包装技术,获得表达该片段的病毒株.经过病毒转染实验,获得表达CAR融合蛋白的稳转NK细胞株.PCR及Western blot证实,CAR融合蛋白在NK细胞表达.细胞杀伤实验证实CARNK细胞分泌细胞因子cd107a的能力明显优于对照组,具有明显的杀伤多发性骨髓瘤细胞的效应.结论:CAR能在体外构建并在NK92细胞表面表达,CARNK细胞能杀伤表达CD138抗原的多发性骨髓瘤细胞株,从而发挥抗骨髓瘤效应.
