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DC-CIK 联合索拉菲尼对肺腺癌细胞的抗瘤效应及机制研究
目的：研究树突状细胞共培养的细胞因子诱导的杀伤细胞（dendritic cell co-cultured cytokine-induced killer cells，DC-CIK）联合索拉菲尼对肺腺癌细胞 A549（KRAS 基因突变型）和 PC-9（EGFR 基因突变型）的抗瘤效应及其机制。方法从肺癌患者外周血单个核细胞（PBMC）中常规诱导 DC 与 CIK，1周后共培养，收集第7天 DC-CIK，流式细胞术（FCM）分析其表型。MTT 法检测索拉菲尼对肿瘤细胞的半数抑制浓度（IC50）。以 DC-CIK 和/或索拉菲尼处理肿瘤细胞，CCK-8法和实时无标记细胞分析技术（real-time cellular analysis，RTCA）分别检测和动态监测肿瘤细胞的增殖情况；Annexin-V/ PI 双染法检测凋亡率。实时荧光定量 PCR 及 FCM 分别检测索拉菲尼作用24 h 后自然杀伤细胞活化性配体（NKG2DLs）的 mRNA 和蛋白表达。结果索拉菲尼对 A549和 PC-9作用24 h 的IC50差异无统计学意义（P﹥0.05）。联合组中的增殖抑制率和总凋亡率显著高于单一因素组，且增殖抑制率随效靶比增加而提高（P﹤0.05）；而联合组中的标准化细胞指数明显低于单一因素组。NKG2D封闭可以减弱 DC-CIK 的增殖抑制作用（P﹤0.05）。5μmol/ L 索拉菲尼作用24 h 后，肿瘤细胞中NKG2DLs（ULBP1、UBLP2、ULBP3）的 mRNA 和蛋白质的表达量均有不同程度增加。结论索拉菲尼对 KRAS 基因突变型和 EGFR 基因突变型肺腺癌细胞的增殖抑制作用差异无统计学意义；DC-CIK 联合索拉菲尼对肿瘤细胞的抗瘤作用明显优于单一因素，可能是通过调节 NKG2D-NKG2DLs 通路和凋亡诱导作用实现的。
关键词： 肺腺癌 索拉菲尼 细胞因子诱导的杀伤细胞 树突状细胞 免疫治疗 -
胃癌患者外周血TH1/TH2细胞因子水平的观察
胃癌是当今世界范围内在发病和死亡中常见的恶性肿瘤之一,严重威胁着人类的健康.我们应用流式细胞仪检测胃癌患者外周血CD4+T细胞中TH1/TH2细胞因子的水平,探讨胃癌患者体内TH1/TH2细胞的反应状态,为胃癌的免疫治疗提供实验依据.
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弱酸洗脱提取的肿瘤抗原肽致敏的树突状细胞对CTL的体内外激活效应
目的 弱酸洗脱提取小鼠红白血病细胞膜表面肿瘤抗原肽,用于致敏树突状细胞(dendritic cells,DC),观察其对细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的体内外激活效应.方法 以pH3.3的枸橼酸-磷酸盐缓冲液室温下处理FBL-3小鼠红白血病细胞5 min,流式细胞术检测洗脱效率;弱酸洗脱的抗原肽经SepPak C18柱提取纯化,用于致敏DC,检测其体外刺激CTL细胞株增殖的能力及体内激发特异性抗肿瘤免疫应答的能力.结果 弱酸可以洗脱肿瘤细胞膜表面绝大部分与MHCⅠ类分子结合的抗原肽;经此抗原肽致敏的DC,体外可以激发特异性识别FBL-3细胞抗原九肽CCLCLTVFL的CD8+CTL细胞株增殖,回输小鼠,可以诱导体内生成高水平的特异性CTL活性,使小鼠获得抵抗后继FBL-3细胞攻击的免疫保护能力,并显著高于肿瘤冻融抗原致敏的DC回输组.结论 弱酸可以有效洗脱肿瘤细胞表面的Ⅰ类抗原肽,该类多肽致敏的DC,在体内外均可激活CTL,有效地诱导特异性抗肿瘤免疫功能.
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抗CD20scFv-Fc-CD28/ζ基因修饰T细胞靶向杀伤Raji细胞的研究
目的 研究重组抗cD20scFv-Fc-CD28/ζ基因修饰T淋巴细胞在杀伤Raji细胞时T细胞活化情况和诱导Raji细胞凋亡的变化,进一步探讨特异基因修饰T细胞杀伤淋巴瘤细胞的机制.方法 将重组质粒转染至PA317细胞中,用转染成功的PA317培养液感染外周血T淋巴细胞后,用800μg/ml的G418筛选1周后杀伤Raji细胞,分别在不同时间点用流式细胞仪检测Raji细胞Bcl-2的阳性率,用ELISA检测培养上清液中的IL-10、IFN-γ.结果 Raji细胞Bcl-2的阳性率在24 h内就明显下降,72 h内由98.43%下降到38.45%,下降幅度明显高于对照组和空白组.72 h检测IL-10发现实验组为100.3 pg/ml,明显低于对照组(210.88 pg/ml)和空白组(286.71 pg/ml),同时IFN-γ的分泌量(1487.23 pg/ml)也显著高于对照组.结论 抗CD20介导的T细胞靶向杀伤Raji细胞不需要CD28的协同刺激.CD28和CD3ζ协同刺激可增强T细胞抑制Raji细胞TL-10表达使其降低Bcl-2的表达从而加速靶细胞的裂解.CD28/ζ在没有外源协同刺激分子B7/CD28时能允分激活T细胞,促进其分泌IFN-γ,增强了抗CD20修饰T细胞靶向杀伤Raji细胞的能力.
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人外周血CD123+髓系树突状细胞的体外诱导及生物学特性研究
树突状细胞(DC)是功能强大的专职抗原提呈细胞,根据其表面标记,DC分为髓系DC(myeloid-DC,mDC)和浆细胞样DC(plasmacytoid-DC,pDC)两个大的亚群,前者主要用于抗肿瘤免疫治疗,后者主要参与免疫耐受.
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MAGE-3抗原冲击外周血单个核细胞诱导抗肿瘤免疫应答
MAGE-3基因的表达产物是一种肿瘤排斥抗原,在抗肿瘤免疫治疗中可作为靶抗原.本实验以原核表达GST-MAGE-3融合蛋白,体外观察MAGE-3蛋白抗原冲击外周血单个核细胞(Peripharal blood mononuclear cells,PBMCs),能否诱导特异性的抗肿瘤免疫应答.
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31例SARS康复者血浆抗体检查结果分析
初步证实严重急性呼吸道综合征(severe acute respiratory syndrome,SARS)康复者的血浆存在特异性的对SARS病原具有中和作用的抗体,可用于免疫治疗.我们近期组织了31例SARS康复者志愿献浆,31例均为2003年1月至4月期间感染SARS病原经治疗康复出院者,并再次回顾性进行了SARS临床诊断确认,其中:男11例,女20例,年龄19～42岁,平均26岁.
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标准化粉尘螨疫苗鼻腔免疫治疗的疗效和机制初探
变态反应疾病临床上常见的有哮喘和过敏性鼻炎等.哮喘是一种以肺部嗜酸粒细胞浸润和对各种激发因子产生气道高反应为特征的慢性气道炎性疾病,是一种常见病和多发病,尘螨是引发哮喘和变应性鼻炎重要的致敏原之一,80%的哮喘患者对尘螨过敏,采用尘螨诱发的哮喘模型能够更好地反映人体的哮喘情况[1].
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含氮二膦酸盐/IL-2诱导肿瘤患者外周血γδT细胞增殖的作用
目的 探讨药物(含氮二膦酸盐联合IL-2,N-BP/IL-2)诱导实体肿瘤患者外周血γδT细胞增殖作用.方法 采用流式细胞仪测定103例肿瘤患者和43例健康人外周血总T细胞绝对值、γδT细胞绝对值和相对值,测定患者外周血经药物体外刺激后γδT细胞增殖指数和用药前后患者外周血总T细胞、γδT细胞绝对值和相对值.结果 肿瘤患者和健康人外周血总T细胞绝对值、γδT细胞绝对值和γδT细胞相对值的中位数,分别为1306细胞/μl和1522细胞/μl(P=0.003),64细胞/μl和162细胞/μl(P＜0.001),5%和11%(P＜0.001).24例经药物体外扩增试验阳性的肿瘤患者治疗前后体内外周血总T细胞绝对值、γδT细胞绝对值和γδT细胞相对值的中位数,分别为1283细胞/μl和1552细胞/μl(P=0.001),54细胞/μl和107细胞/μl(P＜0.001),6%和8%(P=0.008).全部肿瘤患者中外周血γδT细胞对药物体外诱导增殖反应阳性患者的百分率为68.9%.结论 肿瘤患者外周血γδT细胞计数显著低于健康人.不同肿瘤患者外周血γδT细胞对药物刺激增殖的反应性不同.N-PB/IL-2在体内有显著增加γδT细胞数量的药理作用.体外增殖试验可作为N-PB/IL-2治疗患者的参考.
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CTLA-4和PD-1：恶性淋巴瘤免疫治疗中潜在的作用靶点
人体免疫系统具有根除病原体同时限制自身过度炎症反应,避免周围组织损伤的重要调节功能。这种免疫自限性平衡主要由抗原提呈细胞( antigen presentation cell,APC)和T细胞之间复杂的相互作用而控制。然而在恶性肿瘤中,该免疫平衡被破坏,导致肿瘤细胞发生免疫逃逸,进而致使肿瘤细胞无限增殖甚至转移,或者促进肿瘤细胞耐药性。其中免疫检查点扮演着关键作用。因此靶向这些免疫检查点,阻断肿瘤细胞免疫逃逸成为当前复发/难治性恶性肿瘤治疗的研究热点。在恶性淋巴瘤中,目前一些关于免疫检查点抑制剂的Ⅰ/Ⅱ期临床研究正在进行或已结束,并取得了令人惊喜的疗效,其治疗前景值得期待。本文将对恶性淋巴瘤的免疫检查点在微环境中的调节及以其为靶点的新临床治疗进展做一综述。
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钙离子通道调节细胞在抗结核作用方面的研究进展
结核病是由结核分枝杆菌（ MTB ）感染引起的慢性传染病。 MTB可能侵入人体全身各种器官，但主要侵犯肺脏，称为肺结核病。目前，全球已有20亿人感染MTB，仅在2012年，新发结核患者达860万，有130万人因结核病死亡［1］。2012年我国结核病新发患者人数约为90万，占全球的10．5％，位居全球第二位［1］。目前结核病的预防和治疗遇到的主要挑战在于：（1）流动人口感染及隐性感染患者数量庞大；（2）在应对耐多药结核病（ MDR-TB）方面取得的进展仍然十分缓慢；（3）免疫低下人群合并感染［2］。单凭目前已有的化疗方案很难应对上述挑战，因此应当致力于开发新的治疗方法，这包括新药的研发、免疫治疗以及基因治疗等综合方法的运用。
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肿瘤免疫治疗的耐药机制研究进展
肿瘤免疫治疗是利用机体免疫系统特异性识别和杀伤的原理来达到治疗肿瘤的目的 .目前研究比较热门的肿瘤免疫治疗主要包括PD-1/PD-L1抗体、CTLA-4抗体、CAR-T和TCR-T等,并在临床上已观察到前所未有的持久反应,然而仍有部分患者不能从这些免疫治疗中获益;此外一些患者即便获得缓解,一段时间后又复发,表现出对免疫治疗的耐药.从发生时间来看,肿瘤免疫治疗耐药可分为原发性耐药、适应性耐药和获得性耐药,这些耐药可发生在肿瘤免疫应答过程中的每一个环节.本文将对肿瘤免疫治疗的耐药机制进行综述,并为其联合治疗以克服耐药提供理论依据.
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肿瘤新抗原在肿瘤精准免疫治疗中的应用
体细胞突变形成的肿瘤新抗原被MHC分子提呈后可激活免疫系统,产生特异性的抗肿瘤效应.靶向肿瘤新抗原制备的治疗性疫苗和特异性T细胞可实现肿瘤的精准免疫治疗.随着新抗原预测技术的不断发展,个性化肿瘤免疫治疗方案将会广泛推广.本文综述了肿瘤新抗原的预测方法、临床应用研究现状,以及存在的问题.
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微生物与肿瘤免疫关系的研究进展
微生物与肿瘤的发生发展密切相关,微生物可通过免疫系统,影响肿瘤的发生发展和转移.本文从肿瘤发展过程中,微生物与巨噬细胞、T细胞、骨髓来源的抑制性细胞和其他免疫细胞的相互作用的关系做一综述,并总结微生物影响的抗肿瘤免疫治疗,提高人们对微生物影响肿瘤机制的全面认识,为肿瘤的预防、免疫治疗新疗法提供参考.
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肿瘤免疫治疗新靶点OX40的研究进展
OX40属于肿瘤坏死因子受体家族,主要表达在活化的淋巴细胞表面.OX40及其配体OX40L是机体免疫应答中重要的协同刺激分子,可改善肿瘤微环境中的免疫抑制作用,增强效应性淋巴细胞杀伤能力,在介导肿瘤免疫应答发生发展中具有重要作用.临床前动物研究显示,OX40靶点激动剂单用或者与其他治疗方式联用均能发挥明显的抗肿瘤作用.目前已有多个OX40靶点激动剂的早期临床研究在开展.本文将从分子生物学特征、作用机制、单药及联合用药等方面综述OX40作为肿瘤免疫治疗新靶点的研究进展.
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HPV16E7E6重组腺病毒的构建及免疫效果评价
目的 构建用于宫颈癌治疗的HPV16E7E6重组腺病毒并评价其免疫效果.方法 根据哺乳细胞使用密码子的偏嗜性设计HPV16E7E6融合蛋白表达优势密码子基因序列并合成.将合成的E7E6基因插入腺病毒重组穿棱质粒pCD316后,与Ad5腺病毒骨架质粒共转染293细胞,重组病毒经单斑纯化并进行目的基因插入及表达的鉴定.扩增纯化重组病毒后免疫小鼠,评价其免疫活性.结果 PCR试验证明E7E6密码子优化基因成功插入Ad5病毒；Western blot检测结果表明重组腺病毒中E7E6优化基因能高效表达,该重组腺病毒免疫C57小鼠后,可诱发强特异性T细胞免疫应答,在小鼠体内能完全抑制5×104 TC-1移植瘤细胞的生长.结论 重组HPV16E7E6腺病毒可作为治疗HPV慢性感染或宫颈癌的候选疫苗.
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人参皂甙Rg3促进自体外周血干细胞移植后免疫重建的临床观察
大剂量放化疗联合自体造血干细胞移植(AH-SCT)系治疗恶性血液肿瘤及部分实体瘤的新疗法之一[1].然而,移植后仍有部分病人出现复发和转移.移植后免疫功能的状态及免疫治疗对清除体内残留肿瘤细胞和移植后的抗感染作用都至关重要[2].因此移植后的免疫重建及免疫治疗已成为当今造血干细胞移植领域研究的热点之一.
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CD80/IgG融合基因重组表达载体的构建及在CHO细胞中功能性表达的研究
目的构建CD80/IgG真核表达载体,使其在中国地仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovurm,CHO)中功能性表达,寻找消除白血病细胞免疫逃逸的有效方法.方法采用定向分子克隆技术将小鼠CD80胞外段和IgG1 Fc段的cDNA串联至真核表达载体pcDNA3.0中,运用脂质体将所得的重组子转染CHO细胞,经免疫印迹、斑点ELISA检测其表达,免疫亲和层析法纯化其表达产物,用流式细胞术、MTT比色法及ELISA在体外检测该产物的生物学活性.结果两段目的基因按预期设想克隆入空载体中并得到了表达,亲和层析纯化获得了高纯度目的蛋白,该蛋白能够将白血病细胞表面CD80分子密度提高5倍,并可显著增强同种异体小鼠淋巴细胞的增殖、对白血病细胞的杀伤以及Ⅱ-2的分泌.结论成功构建了融合基因真核表达载体,其表达产物在体外具有相应的生物学功能,有希望成为消除白血病细胞免疫逃逸的有力工具.
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编码AFP-CTLA4融合蛋白的DNA疫苗诱导小鼠抗肿瘤免疫的研究
目的构建能够表达AFP和CTLA4融合蛋白的DNA疫苗并检测其诱导特异性CTL反应及抗产生AFP肿瘤的能力.方法利用RT-PCR从Hepa1-6细胞总RNA中克隆mAFP基因.连接mAFP基因和编码小鼠CTLA4膜外部分的基因构建质粒DNA疫苗.对此疫苗进行酶切、测序和表达鉴定.用pmAFP稳定转染EL-4细胞建立EL-4(mAFP)细胞系.以此DNA疫苗免疫小鼠,用ELISPOT检测免疫后小鼠脾脏细胞中产生IFN-γ的细胞频数.以EL-4(mAFP)肿瘤细胞攻击免疫后小鼠,观察肿瘤的生长情况.另外,对免疫的小鼠采血进行肝、肾功能检测.结果利用RT-PCR从Hepa1-6细胞总RNA中成功克隆出1.8kb的mAFP基因.酶切、测序和表达鉴定证实编码mAFP-CTLA4融合蛋白的DNA疫苗构建成功.RT-PCR证实EL-4(mAFP)细胞中有mAFP mRNA的表达.ELISPOT检测结果显示:pmAFP-CTLA4免疫组产生IFN-γ的细胞频数显著高于pmAFP组、pcDNA3.1组和PBS组.pmAFP-CTLA4免疫组小鼠的肿瘤体积为(385.93±52.9)mm3,明显小于pmAFP组(1042.42±123.71)mm3、pcD-NA3.1组(2292.38±276.94)mm3和PBS组(2303.5±233.13)mm3,P均＜0.01.各组肝、肾功能差异无统计学意义.结论编码mAFP-CTLA4融合蛋白的DNA疫苗能诱导产生AFP特异性的CTL增殖并诱导小鼠产生明显的抗肿瘤免疫力,此疫苗对小鼠肝、肾功能不产生影响.
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跨膜型超抗原SEA融合蛋白的表达及其对小鼠黑色素瘤的免疫治疗作用
目的制备跨膜型超抗原融合蛋白,研究该蛋白制备的肿瘤疫苗的抗肿瘤作用. 方法用已构建的重组跨膜型超抗原的表达载体pET-28a-TM-SEA转化E.coli BL21(DE3)pLysS 宿主菌,在IPTG诱导下产生目的蛋白;用Ni-NTA His Bind Resin纯化带有His-Tag的目的蛋白.采用免疫组化法、免疫荧光法和流式细胞术检测其对细胞膜的锚定作用.建立C57BL/6小鼠的黑色素瘤模型,观察跨膜型超抗原SEA融合蛋白制备的肿瘤疫苗对荷瘤小鼠的免疫治疗作用. 结果跨膜型超抗原融合蛋白能够锚定在肿瘤细胞膜上.融合蛋白制备的肿瘤疫苗能够显著抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长,并延长其生存期. 结论跨膜型超抗原融合蛋白制备的肿瘤疫苗具有较强的抗肿瘤作用,有可能作为一种有效的新型疫苗用于肿瘤的治疗和预防.
