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人干细胞白血病基因重组慢病毒载体的构建及其在Cajal样间质细胞中的表达

于建超;王江平;李应龙;钱彪;倪钊;王新敏;李强;王勤章

摘要: 目的 构建含人干细胞白血病(SCL)基因的重组慢病毒载体,并转染体外培养的Cajal样间质细胞(ICC),为进一步利用慢病毒表达载体行体内实验奠定基础.方法 通过聚合酶链反应(PCR)将人SCL基质粒内的遗传物质扩增,与慢病毒载体质粒GV287-EGFP结合,构建重组质粒GV287-EGFP/SCL,通过Western blot检测及基因测序对阳性克隆进行鉴定,并测定病毒滴度.体外分离、培养及鉴定ICC,重组慢病毒载体以感染复数(MOI)值为0.5、1.0、5.0、10.0、50.0和100.0时,分别转染ICC,通过激光共聚焦显微镜观察,计算不同MOI值的转染效果,确定佳MOI值.重组慢病毒载体以佳MOI值感染ICC作为实验组,以空载体转染的ICC(空载体组)及未转染的ICC(空白组)作为对照,通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测SCL基因在ICC中的表达.结果 经Western blot检测及基因测序鉴定SCL重组慢病毒表达载体构建成功,并成功转染ICC,激光共聚焦显微镜下可观察到强绿色荧光.MOI为10时转染效果佳,转染效率>85%;RT-PCR结果表明,实验组SCL基因的表达量高于空载体组和空白组.结论 成功制备人SCL基因重组慢病毒载体,并能高效转染ICC,介导SCL基因在ICC中表达.

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