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RNA干扰抑制UHRF1基因表达对食管癌细胞放射增敏作用的研究
目的 研究RNA干扰抑制UHRF1表达对食管癌细胞系(TE-1)放射敏感性的影响及作用机制.方法 以慢病毒感染方法将UHRF1基因的短发夹状RNA (shRNA)转入TE-1细胞,并分为未转染组、转染NC-shRNA组、转染UHRF1-shRNA组,前二者为对照组.采用RT-PCR和蛋白印记法检测转染前后细胞UHRF1的mRNA和蛋白表达,成克隆法、流式细胞术及蛋白印记法检测转染UHRF1-shRNA联合X线照射对TE-1细胞放射敏感性、周期、凋亡及DNA损伤标识蛋白γ-H2 AX的影响.结果 转染UHRF1-shRNA后TE-1细胞UHRF1的mRNA和蛋白表达受抑(0.11、0.96、0.98,F=124.21,P=0.000;0.10、0.89、0.94,F=125.25,P=0.000).X线照射后转染UHRF1-shRNA组放射增敏比分别为1.53(D0值比)和1.95(Dq值比).X线照射可引起TE-1细胞G2+M期阻滞、凋亡率和γ-H2 AX表达增加,与对照组相比转染UHRF1-shRNA组照后24的G2 +M期阻滞显著降低(F=500.15,P=0.000)、凋亡率和γ-H2 AX残存量明显升高(F=100.10、61.00,P=0.000、0.000).结论 RNA干扰可有效抑制TE-1细胞UHRF1表达,增强细胞放射敏感性,其增敏机制与周期调控、凋亡及DNA损伤修复有关.
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抑制UHRF1基因表达对肝癌细胞生物学行为的影响
目的 探讨抑制泛素样含PHD和环指域1 [ubiquitin-like with plant homeodomain(PHD)and ringfinger domains 1,UHRF1]基因表达对肝癌MHCC-97H细胞增殖、周期分布和凋亡的影响.方法 合成UHRF1基因特异性小发夹RNA(small hairpin RNA,shRNA),构建稳定干扰UHRF1基因表达的重组慢病毒LV-shUHRF1作为LV-shUHRF1组,并将其感染MHCC-97H细胞;以空载体慢病毒LV-shNC作为阴性对照组即LV-shNC组.采用蛋白质印迹法检测UHRF1蛋白在MHCC-97H细胞中表达情况,采用CCK-8法和流式细胞术检测2组MHCC-97H细胞增殖、周期分布和凋亡情况.结果 蛋白质印迹法显示, LV-shUHRF1组细胞UHRF1蛋白表达量为0.018±0.010,LV-shNC组细胞UHRF1蛋白表达量为0.818±0.031,LV-shUHRF1组细胞UHRF1蛋白表达水平明显低于LV-shNC组(P<0.05).LV-shUHRF1组细胞的增殖能力明显低于LV-shNC组(P<0.05),G0/G1期细胞比例和细胞凋亡率明显高于LV-shNC组(P均<0.05),S期细胞比例明显低于LV-shNC组(P<0.05).结论 通过慢病毒介导的RNA干扰技术抑制UHRF1的表达后可抑制MHCC-97H细胞的增殖,阻滞细胞周期进展,促进细胞凋亡,抑制肝癌的发生和发展.
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抑制UHRF1基因表达对肝癌细胞MHCC-97H迁移的影响及相关机制
目的 探讨通过RNA干扰抑制泛素样含PHD和环指域1(UHRF1)基因表达对肝癌MHCC-97H细胞迁移的影响及可能机制.方法 合成UHRF1基因特异性小发夹RNA(shRNA),构建稳定干扰UHRF1基因表达的重组慢病毒LV-shUHRF1(以空载体慢病毒LV-shNC作为阴性对照),并将其感染MHCC-97H细胞.实时荧光定量PCR法检测UHRF1 mRNA在MHCC-97H细胞中表达情况,蛋白质印迹法检测UHRF1、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)和血管内皮生长因子(VEGF)蛋白表达情况,Transwell法检测MHCC-97H细胞迁移能力.结果 LV-shUHRF1组UHRF1mRNA和蛋白表达量及MMP-9、VEGF蛋白表达量均明显低于LV-shNC组(P均<0.05),迁移细胞数明显少于LV-shNC组(P<0.05).结论 通过慢病毒介导的RNA干扰技术抑制UHRF1的表达后可抑制MHCC-97H细胞的迁移能力,机制可能与影响MMP-9和VEGF的表达有关.
关键词： RNA干扰 UHRF1基因 肝癌 细胞迁移 MHCC-97H细胞 -
UHRF1基因沉默对逆转人肺腺癌A549细胞顺铂耐药性的影响
目的:检测泛素样含PHD和环指域1(ubiquitin-like with PHD and ringfinger domain 1,UHRF1)基因在人肺腺癌顺铂(cisplatin,DDP)耐药细胞株A549/DDP及其亲本细胞株A549中的表达差异,并探讨沉默UHRF1基因对逆转A549/DDP细胞对DDP耐药性的影响.方法:采用半定量RT-PCR和蛋白质印迹法检测UHRF1 mRNA和蛋白在A549及A549/DDP细胞中的表达差异.随后构建靶向沉默UHRF1基因的短发夹RNA (short hairpin RNA,shRNA)质粒表达载体,并采用慢病毒感染法感染至A549/DDP细胞,同时设未进行感染的空白对照组和感染非特异性shRNA的阴性对照组.采用蛋白质印迹法检测各组细胞中UHRF1蛋白的表达水平.采用MTT法检测各组细胞在DDP作用下的半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50).采用FCM法检测细胞凋亡率.采用蛋白质印迹法检测凋亡调节因子Bcl-2和Bax的表达情况.结果:UHRF1 mRNA和蛋白在A549/DDP细胞中的表达水平显著高于亲代A549细胞(P＜0.01).靶向UHRF1基因的shRNA明显下调A549/DDP细胞中UHRF1蛋白的表达水平(P＜0.01).在不同浓度DDP作用24 h后,UHRF1-shRNA组A549/DDP细胞的IC50值明显低于空白对照组和阴性对照组,对DDP的敏感性显著提高(P值均＜0.01).DDP(6 mg/L)作用24 h后,UHRF1-shRNA组细胞的凋亡率及促凋亡蛋白Bax的表达水平较空白对照组和阴性对照组明显增高,而抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平则明显下调(P值均＜ 0.01).结论:UHRF1基因在人耐药肺腺癌细胞中呈现高表达,提示UHRF1参与肺腺癌耐药的形成;UHRF1-shRNA可特异性下调UHRF1的表达,逆转A549/DDP细胞对DDP的耐药性,并通过调节凋亡相关基因的表达促进其凋亡.UHRF1基因可能成为逆转肺癌耐药性的一个新的分子靶点.
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UHRF1基因沉默可促进人肺腺癌A549细胞的凋亡
目的:探讨慢病毒介导的shRNA干扰泛素样含PHD和环指域1[ubiquitin-like with plant homeodomain (PHD) and ringfinger domain 1,UHRF1]基因表达对人肺腺癌A549细胞凋亡的影响及其可能的作用机制.方法:应用蛋白质印迹法从4条针对UHRF1基因的RNA干扰慢病毒载体中筛选出1条敲减效率高的pGC-UHRF1-shRNA-LV-GFP#1包装成慢病毒.实验设未进行感染的空白对照组、感染非特异性shRNA的阴性对照组和感染pGC-UHRF1-shRNA-LV-GFP#1的UHRF1 shRNA组.慢病毒感染A549细胞后,应用RT-PCR法检测各组细胞中UHRF1 mRNA的表达水平,蛋白质印迹法检测各组细胞中UHRF1、Bax、caspase 9和Bcl-2蛋白的表达水平;FCM法检测各组细胞的凋亡情况.结果:慢病毒pGC-UHRF1-shRNA-LV-GFP#1感染A549细胞后明显下调UHRF1 mRNA和蛋白表达水平(P值均＜0.01).UHRF1 shRNA组A549细胞的凋亡率显著高于空白对照组和阴性对照组(P＜0.01),抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平显著下调(P＜0.01),而促凋亡蛋白Bax和caspase 9的表达水平显著上调(P值均＜0.01).结论:慢病毒介导的shRNA沉默UHRF1基因表达可促进人肺腺癌A549细胞的凋亡,其作用可能与上调Bax、caspase 9蛋白表达和下调Bcl-2蛋白表达有关.
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UHRF1基因在食管癌中的表达和意义
目的 研究UHRF1基因在食管癌组织及癌旁正常组织中的表达及临床意义.方法 对62例食管癌组织及癌旁正常组织应用半定量反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测其中UHRF1 mRNA表达水平；应用Westernblot法检测62例食管癌组织及对应癌旁正常组织中UHRF1蛋白的表达；同时分析UHRF1的表达与患者临床病理特征之间的关系.结果 食管癌组织中UHRF1 mRNA的表达水平显著高于正常组织(P＜0.01)；Westernblot结果显示在70.9％ (44/62)的食管癌组织中UHRF1蛋白表达较癌旁正常组织高(P ＜0.001)；统计分析结果发现,UHRF1蛋白及mRNA的表达与食管癌患者的淋巴结转移、浸润深度等均无显著性相关(P＞0.05),而与食管癌的分化程度呈负相关(r=-0.176,P＜0.05),分化程度越低者UHRF1表达越高,各不同分化组间UHRF1表达差异具有统计学意义(P=0.001),UHRF1高表达患者的五年生存率较差.结论 UHRF1在食管癌组织中的表达量显著升高,而且与食管癌分化程度和患者预后相关,可能成为判断食管癌及预后的重要分子生物标志.
关键词： UHRF1基因 反转录聚合酶链反应 Western印迹法 食管肿瘤 -
UHRF1基因在人卵巢癌细胞株OVCAR-3中的表达及意义
目的:探讨针对UHRF1基因的小干扰RNA(siRNA)转染人卵巢癌细胞株OVCAR-3后UHRF1表达的变化及细胞的增殖和凋亡,为UHRF1基因作为新的靶点治疗卵巢癌提供依据.方法:用siRNA基因沉默技术,将体外化学合成的针对UHRF1基因的siRNA转染至OVCAR-3细胞(转染组),并以转染阴性对照siRNA序列的细胞作为阴性对照组,未经转染的细胞作为空白组；实时荧光定量PCR和Western blot分别检测转染前后细胞UHRF1 mRNA和蛋白表达水平的变化；CCK-8实验和流式细胞术分别检测沉默UHRF1基因后对细胞增殖和凋亡的影响.结果:实时荧光定量PCR结果显示,siRNA转染后UHRF1基因在卵巢癌细胞株OVCAR-3中表达显著降低(P＜0.01).Western blot结果显示,转染组、阴性对照组和空白组细胞UHRF1蛋白相对表达量分别为0.16±0.04、0.33±0.03、0.35±0.07；转染组细胞UHRF1蛋白表达水平显著低于阴性对照组和空白组(P＜0.05),而阴性对照组和空白组之间无显著差异(P＞0.05).CCK-8实验结果显示,转染后48,72,96h,转染组细胞增殖率均显著低于空白组(P＜0.01).流式细胞术结果显示,转染组、阴性对照组细胞凋亡率分别为(15.83±2.22)％、(7.46±2.93)％,差异显著(P＜0.01).结论:UHRF1基因沉默后可显著抑制卵巢癌OVCAR-3细胞UHRF1的表达,并抑制细胞增殖,促进细胞凋亡.
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下调UHRF1的表达在抑制肝癌进展中的作用
目的 探讨UHRF1的异常表达在肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)进展中的作用机制.方法 采用RT-PCR和Western blot法检测UHRF1在20例HCC标本中的mRNA和蛋白表达水平,Western blot法检测不同转移潜能的肝癌细胞HepG2、SMMC7721、MHCC97L和HCCLM3中的UHRF1的表达水平;siRNA技术干扰HCCLM3细胞中UHRF1表达后,MTT法检测细胞增殖,Western blot 法检测BAX和BCL-2表达水平的改变,流式细胞术检测HCCLM3细胞周期和细胞凋亡的变化.结果 UHRF1在肺癌组织中的表达水平较癌旁组织显著上调(P＜0.05),随着肝癌细胞转移潜能升高而UHRF1表达水平也依次升高(P＜0.01);siRNA技术干扰HCCLM3细胞中UHRF1表达后,HCCLM3细胞生长速度明显下降(P＜0.05),HCCLM3细胞的促凋亡蛋白BAX表达水平明显上升,而抑凋亡蛋白BCL-2表达水平明显下降;UHRF l-siRNA干扰HCCLM3细胞48 h时,细胞周期分布无明显影响(P＞0.05);但UHRF1表达下调有促凋亡作用,与对照组相比,干扰组的细胞凋亡率显著升高,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 UHRF1基因在肝癌组织中表达上调,下调UHRF1的表达能够抑制肝癌进展,可能是通过诱导肿瘤细胞凋亡来实现的.
