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红花黄色素对人肝癌细胞凋亡及相关蛋白表达的影响
目的:探讨红花黄色素(safflor yellow,SY)对MHCC-97H细胞凋亡及相关蛋白表达的影响.方法:选用MHCC-97H细胞体外培养至对敷生长期,加入不同浓度SY(0、0.03125、0.0625、0.125、0.25、0.5 mg/L)进行体外培养,并设顺铂阳性对照组(终浓度0.5 μg/ml),分别干预24 h、48 h及72 h后,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法观察SY对细胞增殖的抑制作用,流式细胞仪观察细胞周期及凋亡率的变化,Western-blotting检测Bax、Bel-2蛋白表达情况.结果:MTT显示SY对人肝癌细胞MHCC-97H增殖有一定的抑制作用,与SY浓度及作用时间有相关性;流式细胞术显示,细胞凋亡率随SY浓度增加有上升趋势,细胞周期无明显变化:Western-blotting显示,随着SY浓度的增加,Bax表达增加,Bcl-2表达减少,而Bcl-2/bax比值下降.结论:SY对MHCC-97H细胞的生长有一定的抑制作用,但对细胞周期无明显阻滞作用,其可诱导该细胞凋亡,下调Bcl-2/Bax比值,可能为其促凋亡机制之一.
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抑制UHRF1基因表达对肝癌细胞生物学行为的影响
目的 探讨抑制泛素样含PHD和环指域1 [ubiquitin-like with plant homeodomain(PHD)and ringfinger domains 1,UHRF1]基因表达对肝癌MHCC-97H细胞增殖、周期分布和凋亡的影响.方法 合成UHRF1基因特异性小发夹RNA(small hairpin RNA,shRNA),构建稳定干扰UHRF1基因表达的重组慢病毒LV-shUHRF1作为LV-shUHRF1组,并将其感染MHCC-97H细胞;以空载体慢病毒LV-shNC作为阴性对照组即LV-shNC组.采用蛋白质印迹法检测UHRF1蛋白在MHCC-97H细胞中表达情况,采用CCK-8法和流式细胞术检测2组MHCC-97H细胞增殖、周期分布和凋亡情况.结果 蛋白质印迹法显示, LV-shUHRF1组细胞UHRF1蛋白表达量为0.018±0.010,LV-shNC组细胞UHRF1蛋白表达量为0.818±0.031,LV-shUHRF1组细胞UHRF1蛋白表达水平明显低于LV-shNC组(P<0.05).LV-shUHRF1组细胞的增殖能力明显低于LV-shNC组(P<0.05),G0/G1期细胞比例和细胞凋亡率明显高于LV-shNC组(P均<0.05),S期细胞比例明显低于LV-shNC组(P<0.05).结论 通过慢病毒介导的RNA干扰技术抑制UHRF1的表达后可抑制MHCC-97H细胞的增殖,阻滞细胞周期进展,促进细胞凋亡,抑制肝癌的发生和发展.
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抑制UHRF1基因表达对肝癌细胞MHCC-97H迁移的影响及相关机制
目的 探讨通过RNA干扰抑制泛素样含PHD和环指域1(UHRF1)基因表达对肝癌MHCC-97H细胞迁移的影响及可能机制.方法 合成UHRF1基因特异性小发夹RNA(shRNA),构建稳定干扰UHRF1基因表达的重组慢病毒LV-shUHRF1(以空载体慢病毒LV-shNC作为阴性对照),并将其感染MHCC-97H细胞.实时荧光定量PCR法检测UHRF1 mRNA在MHCC-97H细胞中表达情况,蛋白质印迹法检测UHRF1、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)和血管内皮生长因子(VEGF)蛋白表达情况,Transwell法检测MHCC-97H细胞迁移能力.结果 LV-shUHRF1组UHRF1mRNA和蛋白表达量及MMP-9、VEGF蛋白表达量均明显低于LV-shNC组(P均<0.05),迁移细胞数明显少于LV-shNC组(P<0.05).结论 通过慢病毒介导的RNA干扰技术抑制UHRF1的表达后可抑制MHCC-97H细胞的迁移能力,机制可能与影响MMP-9和VEGF的表达有关.
关键词： RNA干扰 UHRF1基因 肝癌 细胞迁移 MHCC-97H细胞 -
下调EMS1/cortactin对人高转移潜能肝癌细胞株迁移和内吞的影响
目的 观察下调人高转移潜能肝癌细胞株(MHCC-97H)中EMS1/cortactin对细胞迁移和内吞的影响,探讨EMS1/cortactin在细胞内可能存在的功能.方法 构建靶向EMS1的shRNA真核表达质粒(EMS1-PSilencer4.1-GFP-shRNA,EMS1-shRNA);通过Lipofectamine 2000处理后将EMS1-shRNA转染MHCC-97H细胞,免疫荧光显微镜下观察转染效率;采用RT-qPCR和Westen blot分别检测EMS1 mRNA和cortactin蛋白表达水平;利用划痕、Transwell小室实验、转铁蛋白(transferrin,Tfn)内吞实验分别研究细胞迁移和内吞作用.结果 成功构建EMS1-shRNA.免疫荧光显微镜下见转染细胞中明显的绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP),荧光强度在48 h达到峰值,其转染效率达84.76%.与未处理组相比,转染EMS1-shRNA细胞中EMS1 mRNA水平下降至19.00%,cortactin蛋白水平下降至36.74%、细胞相对迁移距离下降至55.52%、相对穿膜细胞数下降至27.79%、细胞内吞荧光标记Tfn水平显著减弱(P均<0.05).结论 下调EMS1/cortactin后,MHCC-97H细胞迁移、内吞能力明显下降,提示EMS1/cortactin与原发性肝癌(primary human heptatocellular,HCC)转移的生物学行为有关.
关键词： MHCC-97H细胞 EMS1/cortactin 核酸干扰 迁移 内吞
