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肌肉游离移植后肌肉萎缩盒F基因和肌肉环状指基因1 mRNA的表达
目的 检测肌肉移植后肌肉萎缩盒F基因(muscle atrophy F-box,MAFbx)和肌肉环状指基因1(mLIsele ring finger 1,MuRFI)mRNA表达的变化,并探讨其与肌肉萎缩和肌肉功能的关系.方法 建立大鼠股薄肌原位游离移植的模型,以自身为对照,应用real-time PCR、电生理等方法,观察MAFbx和MuRFI mRNA表达、肌肉萎缩与肌肉功能的演变,统计学分析三者之间的相关性. 结果肌肉移植术后,肌纤维横截面积、肌肉湿重维持率、肌肉大单收缩力和肌肉强直收缩力维持率均先降低后增加,术后晚期时仍低于对照侧水平(P<0.05)6肌肉移植后MAFbx和MuRFI mRNA在术后3～4周时达到高然后逐渐降低,高达对照侧的7.1倍和4.1倍,术后晚期时仍持续低水平高表达,与对照侧比较差异有统计学意义(P<0.05).结论 肌肉移植后MAFbx和MuRFI mRNA的持续高表达,是肌肉萎缩引起肌肉功能降低的重要联系点.二者可以作为骨骼肌萎缩早期的标记物,也可以作为药物干预的潜在靶点用于治疗肌肉萎缩.
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蛋白泛素途径及其非降解功能研究新进展
泛素化是单个或多个泛素在泛素激活酶、泛素结合酶及泛素蛋白连接酶的作用下共价修饰底物蛋白质的过程.在蛋白质降解的过程中,泛素化标记被蛋白水解酶体特异性识别,发挥着枢纽的作用.而近年来的研究发现,泛素化不仅仅是蛋白质降解的标志,它有更为广泛的用途,参与了大量的生命活动.这些研究极大地丰富了对泛素化蛋白水解系统的认识,也使得在分子水平上对蛋白质降解异常导致的顽疾进行治疗不再是梦想.
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胃癌细胞MGC-803耐药细胞株的建立及分泌蛋白差异分析
目的:应用蛋白质组学技术系统比较5-氟尿嘧啶、紫杉醇及顺铂耐药细胞与敏感细胞的分泌蛋白表达谱,以期发现胃癌耐药相关分泌蛋白标志物,为临床选择有针对性的化疗药物提供依据.方法:通过药物梯度诱导建立胃癌MGC-803耐药细胞株.从培养上清中收集MGC-803亲代及耐药细胞的分泌蛋白,应用双向凝胶电泳(two-dimensional gel electrophoresis,2-DE)进行分离,通过PD Quest 7.1.0软件分析获得差异蛋白,基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)进行鉴定,并用实时定量PCR检测各差异蛋白在耐药细胞株和亲本细胞间mRNA水平上的表达差异.结果:分别建立了对5-氟尿嘧啶、紫杉醇及顺铂耐药指数为110.6、70.0和13.3的耐药细胞株.顺铂耐药细胞对5-氟尿嘧啶和紫杉醇、5-氟尿嘧啶耐药细胞对紫杉醇均有较强的交叉耐药,前者耐药指数分别为23.5和114.0,后者为70.0.制备获得了耐药细胞培养上清的双向凝胶电泳蛋白组分图谱;经PD Quest软件分析获得18个差异在2倍以上、3株耐药细胞培养上清中丰度均增高的蛋白点,其中13个得到了质谱鉴定,它们分别属于蛋白酶类、信号转导分子等.与亲本细胞相比,在mRNA水平上,SLMAP、TOP3A、DYNC1H1、RHPN1、PUF60和SIAH1在3种耐药细胞中皆有明显上调;IFT172、FILIP在耐5-氟尿嘧啶和紫杉醇细胞中上调显著;PLVAP、LMNA在耐紫杉醇及顺铂细胞中表达有所升高,但在耐5-氟尿嘧啶细胞中升高不显著.在蛋白水平上的进一步验证发现,SIAH1在3种耐药细胞中的表达量及培养上清中的含量皆有升高.结论:本研究以胃癌细胞MGC-803为亲本细胞分别建立了针对5-氟尿嘧啶、紫杉醇及顺铂的耐药细胞株,在此基础上应用双向电泳及蛋白质谱技术,整体展示了耐药细胞与亲本细胞的差异分泌蛋白,并发现SIAH1蛋白在耐药细胞总蛋白及培养上清中的含量均明显升高,其有可能成为研发胃癌血清耐药标志物的候选分子.
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泛素蛋白连接酶复合体KPC的研究进展
泛素蛋白酶体途径是真核生物体内重要的蛋白质降解途径之一，其中，目标蛋白的泛素化过程涉及泛素激活酶、泛素结合酶和泛素蛋白连接酶（E 3）。目标蛋白识别中起关键作用的是E 3， Kip1泛素－促进复合体（ KPC）是一种E3复合体，由KPC1和 KPC2组成，KPC1在 C端含有一个环指结构域作为催化亚基，是E3不可缺少的组成部分，KPC2含有一个类泛素结构域和两个泛素相关结构域。 KPC广泛存在于真核生物中，在神经系统疾病、血液系统疾病、肿瘤疾病等方面起着重要的调控作用。
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运动和制动大鼠腓肠肌内p-Akt/MuRF1/FoxO1的蛋白表达变化
本文旨在研究两种运动方式和制动状态下大鼠腓肠肌内p-Akt/MuRF 1/FoxO1的蛋白表达变化,以揭示运动员不同的训练方式和停训状态下肌形态学改变的分子机制.Sprague Dawley (SD)大鼠随机分成对照组、耐力训练组、后肢悬垂组和离心训练组.耐力训练组接受跑台训练,悬吊组接受后肢悬垂,离心训练组接受坡度-16°的跑台训练.各组大鼠取腓肠肌,称取其重量,HE法测定骨骼肌细胞横截面积;免疫组化法测定p-Akt蛋白表达;免疫印迹法测定MuRF1、FoxO1的蛋白表达.结果显示,相对对照组,耐力训练组腓肠肌重量和细胞横截面积无显著变化,而离心训练组和后肢悬垂组显著降低;耐力训练组和离心训练组腓肠肌p-Akt蛋白表达显著增加,后肢悬垂组无明显变化.与对照组相比,耐力训练组MuRF1蛋白表达无明显变化,而离心训练组和后肢悬垂组则显著升高;耐力训练组FoxO1蛋白表达显著降低,而离心训练组与后肢悬垂组则显著升高.以上结果表明,增加活动的运动方式(耐力和离心训练)激活了Akt表达,但没有引起肌肉重量的增加;相反,离心训练和后肢悬垂均显著增加了MuRF1和FoxO1的蛋白表达,导致肌肉萎缩,提示MuRF1和FoxO1是造成肌肉萎缩的主要决定因素.
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肌肉细胞特异性泛素蛋白连接酶在癌性恶液质小鼠骨骼肌中的表达
)g、(108.80±14.82)mg比(125.00±10.00)mg(P＜0.05).荷瘤组腓肠肌中Atrogin-1和MuRF1在mRNA水平表达分别达对照组的24.83和2.9.02倍,其蛋白水平表达也升高.结论 E3表达上调在癌性恶液质肌萎缩发生机制中起重要作用.
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肌肉游离移植后MAFbx表达及肌肉功能实验研究
目的 观察肌肉游离移植后泛素连接酶(MAFbx)mRNA和蛋白表达的变化,以及肌肉萎缩和肌肉功能的动态恢复情况,并探讨三者之间的关系. 方法 雌性SPF级SD大鼠36只,体重(250 ±25)g.随机选取一侧行股薄肌原位游离移植手术,作为实验侧;另一侧不行手术作为对照侧.术后观察大鼠一般情况,于术后1、2、4、10、15和30周,分别取6只大鼠测量实验侧和对照侧股薄肌肌肉收缩能力、肌湿重维持率,HE染色观察肌纤维横截面积,实时定量PCR检测MAFbx/Atrogin-1 mRNA相对表达量,Western blot检测MAFbx蛋白表达. 结果 36只大鼠全部成活,切口愈合好,实验侧肢体功能无障碍.实验侧肌纤维横截面积、肌肉湿重维持率、肌肉大单收缩力维持率和肌肉强直收缩力维持率均呈先降低(术后1～4周)后增加(术后4～30周)的趋势.MAFbx mRNA相对表达量术后2周高,为对照侧7倍;术后15～30周逐渐下降,为对照侧1.1～1.5倍;各时间点实验侧与对照侧比较,差异均有统计学意义(P<0.05).Westernblot检测结果 显示术后1～15周,实验侧肌肉内MAFbx蛋白相对表达量与对照侧相比,差异均有统计学意义(P<0.05);术后30周差异无统计学意义(P>0.05).肌湿重维持率、肌纤维横截面积恢复率分别与大单收缩力维持率和大强直收缩力维持率的相关系数为0.95、0.75和0.93、0.68(P<0.05).MAFbx mRNA及蛋白相对表达量分别与肌肉湿重维持率、肌纤维横截面积恢复率、大单收缩力维持率、大强直收缩力维持率的相关系数为-0.62(P<0.05)、-0.45(P>0.05)、-0.72(P<0.05)、-0.78(P<0.05)和-0.95(P<0.05)、-0.82(P<0.05)、-0.89(P<0.05)、-0.54(P>0.05). 结论 移植肌肉功能降低与肌肉萎缩密切相关.MAFbxmRNA和蛋白表达增高,尤其在获得神经支配后4～15周仍持续升高,可能是肌肉萎缩引起肌肉功能降低的一个联系点.
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基于转录组测序分析宫颈病变中人乳头状瘤病毒16感染对泛素蛋白连接酶、核因子-κB表达的影响
目的 探讨新疆妇女宫颈病变中Toll样受体9(TLR9)和泛素蛋白连接酶(UBC)、核因子-κB(NF-κB)表达与人乳头状瘤病毒16(HPV16)感染的关系.方法 以人乳头瘤病毒(HPV)分型基因芯片检测86例慢性宫颈炎、宫颈上皮内瘤变(CIN)和宫颈癌组织HPV感染及分型;Illumina Hiseq测序平台对15例宫颈病变组织进行转录组测序;通过免疫组化SP法检测TLR9、UBC和NF-κB在慢性宫颈炎、CINⅡ-Ⅲ 和宫颈癌患者石蜡包埋组织中的表达水平.结果 宫颈癌的HPV感染率为100％(41/41),CINⅡ-Ⅲ的感染率为60％(15/25),慢性宫颈炎的感染率为15％(3/20),其中HPV16为主要感染型别;转录组测序结果显示,HPV16阳性的宫颈癌和CINⅡ-Ⅲ组织中与TLR9相关的差异上调表达的基因有12个(NF-κB、UBC、TICAM1、POU2F3、S100A8、NOD2、CDK1、FOS、JUN、MAL、IRF7和RP11-58O9.2);免疫组化结果显示TLR9、UBC和NF-κB在CIN和宫颈癌组织中高表达,其表达水平呈正相关(r分别为0.510和0.469,P值均<0.001).结论 在宫颈癌发展过程中,HPV16感染可能通过泛素-蛋白酶体降解途径影响TLR9蛋白表达,具体调控机制需要深入研究.
