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大鼠全脑缺血后脑内特异性组蛋白赖氨酸去甲基酶1时空表达特点的研究
目的：探讨大鼠全脑缺血损伤前后脑内是否存在特异性组蛋白赖氨酸去甲基酶1（LSD1）及其时间、空间分布规律。方法选择成年SD大鼠126只，免疫组织化学和Western blot各63只制作短暂性全脑缺血模型，大鼠按脑缺血再灌注后不同处死时间随机分为实验组56只（1、6、12 h ，1、3、7、14、30 d），每个时间点7只，对照组7只。用免疫组织化学及Western blot ，观察大鼠LSD1在各脑区的表达。结果免疫组织化学及Western blot结果一致显示，LSD1在缺血前散在分布各脑区，主要分布于海马及前额区皮质。实验组缺血再灌注后1 h LSD1免疫反应阳性细胞明显增高，于6 h达到小高峰，随后缓慢下降，至缺血再灌注后12 h达低点，但齿状回区及CA1区仍明显高于对照组（P＜0．05）。缺血再灌注12 h后，不同脑区表现出各自的时间分布特点：齿状回区1 d、海马CA1区3 d及前额区7 d LSD1第2高峰分别为[（13492．7±639．6）个 vs （614．1±126．6）个，（2371．1±403．2）个 vs （119．3±22．6）个，（1874．7±78．1）个 v s （97．4±15．8）个，P＜0．01]，随后缓慢下降，直至30 d恢复到对照组水平。结论正常状态下，LSD1即存在于大鼠海马齿状回区、CA1区及前额区，并在缺血性脑损伤后呈现不同的时间变化特点。从空间分布、时间变化特点推测，LSD1可能在脑损伤后诸多调节通路中起重要的调节作用。
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干扰SET8抑制血管平滑肌细胞转分化的研究
目的 探讨赖氨酸甲基转移酶SET8对大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)向成骨样细胞分化的影响.方法 体外分离培养大鼠VSMCs,将VSMCs随机分为正常对照组(未转染)、空质粒组(转染NS-shRNA)、SET8-shRNA组.应用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)、蛋白免疫印迹(Western blot)法分别检测SET8和调节成骨与软骨分化的关键转录因子RUNX2 mRNA和蛋白的表达水平;应用酶联免疫法检测碱性磷酸酶(ALP)活性.结果 SET8-shRNA可成功抑制VSMCs中SET8的表达;RT-PCR及Western blot结果显示,SET8-shRNA组RUNX2 mRNA和蛋白的表达较正常对照组和空质粒组明显下降(P<0.05).ALP活性测定结果显示,SET8-siRNA组ALP活性较正常对照组和空质粒组显著降低(P<0.05).结论 干扰SET8基因表达能够抑制大鼠VSMCs向成骨样细胞转分化.
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甲基转移酶SETDB2对肝癌侵袭迁移的影响及其机制研究
目的 检测甲基转移酶SETDB2对肝癌侵袭转移的影响并探讨其机制.方法 应用Western blot、免疫组化以及Real-time PCR等方法检测37例肝癌及对应癌旁组织标本中SETDB2蛋白及mRNA表达情况.将靶向SETDB2的短发卡RNA(sh-SETDB2)和空载体(sh-NC)分别转染至人肝癌MHCC97H细胞构建稳转细胞系,应用Tanswell侵袭实验、细胞划痕实验检测2组细胞的侵袭和迁移能力.通过基因芯片检测敲低SETDB2后表达有变化的基因.敲低SETDB2后,运用Real-time PCR检测PTEN的mRNA的表达变化以及Western blot检测PTEN和组蛋白H3第9位赖氨酸的三甲基化(H3K9me3)的表达变化,CHIP检测H3K9me3在PTEN的启动子区域的变化.在敲低SETDB2的同时敲低PTEN的表达,Tanswell侵袭实验检测细胞侵袭能力的变化.结果 (1)Western blot和Real-time PCR的结果均表明肝癌组织中SETDB2蛋白及mRNA表达水平均高于癌旁组织;SETDB2表达的高低与肝癌组织学分级和TNM分期有关.(2)转染sh-SETDB2的MHCC97H细胞的侵袭和迁移能力均明显低于sh-NC组.(3)基因芯片、Western blot以及Real-time PCR等实验结果显示敲低SETDB2后PTEN表达上调.(4)在敲低SETDB2后H3K9me3表达下调,PTEN启动子区域的H3K9me3减少.(5)与敲低SETDB1组相比,敲低SETDB2的同时敲低PTEN后细胞的侵袭能力恢复.结论 SETDB2通过下调PTEN的表达促进肝癌细胞的侵袭迁移.
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胰腺癌中Ring1B、LSD1及P16表达及其与预后的关系
目的:探讨胰腺癌中E3泛素连接酶亚单位Ring1B、组蛋白赖氨酸特异性去甲基化酶1(LSD1)及细胞周期调节因子P16表达与及其与患者预后的关系.方法:用免疫组化法检测85例胰腺癌患者手术标本(癌组织与癌旁组织)中LSD1、Ring1B与P16蛋白的表达及分布,并选取其中6对癌组织和癌旁组织,用qRT-PCR和Western blot法检测mRNA和蛋白表达;分析三者在胰腺癌组织中表达的相关性,及其与患者生存的关系.结果:免疫组化结果显示,Ring1B与LSD1蛋白主要表达于细胞浆,P16主要表达于胞核;Ring1B与LSD1在胰腺癌组织中表达明显高于癌旁组织,而P16的表达明显低于癌旁组织(均P＜0.05);在胰腺癌组织中Ring1B、LSD1的表达与P16的表达均呈负相关(r=-476;r=-0.673,均P＜0.05).qRT-PCR结果显示,胰腺癌组织中Ring 1B和LSD1的mRNA的平均相对表达量均明显高于癌旁组织(8.908vs.1.947;7.126 vs.1.940,均P＜0.05),P16的mRNA的平均相对表达量明显低于癌旁组织(1.269vs.5.237,P＜0.05);Western blot结果显示,三者的蛋白表达趋势与mRNA表达一致.生存分析显不,Ring1B、LSD1高表达患者生存率均分别低于其低表达患者(x 2=8.958,P=0.012;x 2=8.856,P=0.010),而P16高表达患者生存率高于其低表达患者(x 2=7.867,P=0.024).结论:胰腺癌组织中Ring 1B与LSD1表达升高,P16表达降低;Ring1B、LSD1可能分别通过组蛋白泛素化和去甲基化调控P16的表达,从而影响胰腺癌预后.
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组蛋白甲基转移酶MLL1促进肾小管上皮细胞转分化
目的 检测组蛋白甲基转移酶MLL1在单侧输尿管梗阻(UUO)所导致的肾间质纤维化过程中的表达,探讨其在肾小管上皮细胞间质转分化(EMT)中的作用.方法 将42只雄性SD大鼠随机分为正常组,假手术组,UUO术后1d、1周、2周、3周和4周组,利用实时荧光定量PCR和Western印迹法分别检测大鼠肾组织MLL1、Ⅲ型胶原纤维(Col3α1)的表达及EMT的情况.利用siRNA-MLL1质粒抑制HK-2细胞中MLL1基因的表达后,以TGF-β1进行诱导处理,Western印迹法检测细胞中MLL1、EMT相关指标、Col3α1及组蛋白H3第4位赖氨酸三甲基化(H3K4me3)的蛋白水平;同时利用染色质免疫共沉淀(CHIP)对EMT相关基因启动子区域H3K4me3水平进行检测.结果 (1)与正常和假手术组相比,UUO术后大鼠的肾功能随着梗阻时间的增加不断丧失(P＜0.05).(2)与正常和假手术组相比,UUO术后1周和2周时大鼠肾组织肾间质纤维化为显著(均P＜ 0.05),MLL1及EMT相关指标的表达量也高(均P＜ 0.05).(3)与对照组相比,3 ng/ml的TGF-β1作用细胞后MLL1的表达量高(P＜0.05),而在此浓度下HK-2细胞发生EMT也为显著(P＜0.05).(4)将MLL1敲除后,3 ng/mlTGF-β1所诱导的HK-2细胞EMT被显著抑制(P＜0.05),α-SMA和Vimentin启动子区域的H3K4me3水平也显著下降(P＜0.05).结论 MLL1能够促进TGF-β1所诱导的HK-2细胞EMT的发生,其机制可能是使α-SMA和Vimentin启动子区的组蛋白H3第4位赖氨酸发生三甲基化(H3K4me3).
关键词： 甲基化 组蛋白赖氨酸N-甲基转移酶 纤维化 上皮间质转分化 -
人类DOT1L基因在地西他滨抑制人单核细胞白血病细胞株THP-1增殖中的作用 及机制研究
目的 分析人类DOT1L(hDOT1L)信号途径在地西他滨抑制人单核细胞白血病细胞株THP-1细胞增殖中的作用,探讨其DNA去甲基化以外的可能作用及hDOT1L信号途径参与白血病发生的机制.方法 四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测不同浓度地西他滨对THP-1细胞增殖的影响,锥虫蓝拒染法检测地西他滨对THP-1细胞存活率的影响,反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测hDOT1L、HOXA9、HOXA10、MLL-AF10(MLLT10)mRNA表达水平,蛋白印迹法检测甲基化H3K79蛋白水平.结果 与阴性对照组相比,各浓度地西他滨明显抑制THP-1细胞增殖,72 h抑制作用明显,高抑制率达56.18%,呈时间和浓度依赖性.与阴性对照组相比,除0.5μmol/L地西他滨处理组外,其余各浓度地西他滨对THP-1细胞抑制率差异均有统计学意义(均P<0.05).THP-1细胞内hDOT1L及HOXA9、HOXA10、MLLT10 mRNA水平高H3K79过甲基化,各浓度地西他滨处理48 h后均可降低细胞内hDOT1L mRNA水平,并下调细胞内HOXA9、HOXA10、MLLT10 mRNA水平,与阴性对照组比较差异均有统计学意义(均P<0.01).各浓度地西他滨处理48 h后细胞内H3K79甲基化水平明显降低,以双甲基化和三甲基化H3K79蛋白表达水平下降明显,与阴性对照组比较差异均有统计学意义(均P<0.01).结论 地西他滨可能通过某种机制减少hDOT1L表达水平,降低H3K79甲基化水平,并可能抑制其信号途径中的关键分子HOXA9、HOXA10、MLLT10的表达,发挥其抑制THP-1细胞增殖的作用.
