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4,4'-二异硫氰基芪-2,2'-二磺酸对大鼠缺血再灌注损伤的影响及机制
目的 探讨广谱氯离子通道阻滞剂4,4'-二异硫氰基芪-2,2'-二磺酸(DIDS)对大鼠缺血再灌注损伤心肌细胞凋亡的影响及其机制.方法 雄性SD大鼠36只随机分为3组:缺血再灌注组(A组)、DIDS处理组(B组)和LY294002预处理组(C组).伊文兰和TTC染色测定心肌梗死范围,TUNEL方法定性和定量检测心肌细胞凋亡指数,Western blot测定蛋白激酶B(Akt)的表达.结果 与A组比较,B组心肌梗死范围和心肌细胞凋亡指数明显降低[(38.8士7.7)%μs(54.2士10.8)%,(8.9士1.8)μs(17.6士3.5)%,P<0.01];磷酸化Akt表达水平明显增加(P<0.01).与A组比较,C组梗死面积、凋亡指数无明显减小,磷酸化Akt水平无明显变化(P>0.05).结论 DIDS能够抑制大鼠缺血再灌注所致的心肌细胞损伤,可能是通过信号分子磷脂酰肌酶三羟基激酶/Akt的调节.
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氯通道阻断剂对bFGF作用下人晶状体上皮细胞增殖的影响
目的 观察氯通道阻断剂5-硝基-2(3-苯丙胺)苯甲酸(NPPB)和二异硫氰基芪-2,2'-二磺酸(DIDS)对碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)诱导的人永生系晶状体上皮细胞(HLE) B-3增殖的影响.方法 实验研究.取对数生长期的HLE B-3细胞为研究对象,用10 μg/L bFGF作用的细胞作为bFGF组,常规培养的细胞作为空白对照组,NPPB(50、100、150 μmol/L)及DIDS(10、50、100 μmol/L)分别加入含bFGF的HLE B-3细胞的培养液中共同作用24 h、48 h及72 h,采用CCK-8法、免疫细胞化学法及PI单染流式细胞术检测细胞增殖率、细胞增殖核抗原Ki-67蛋白的表达率及细胞周期的变化,进而观察氯通道阻断剂对其影响.不同浓度的NPPB和DIDS在三个时间段作用后A值差异比较采用双因素方差分析,组内各因素的多重比较采用LSD-t检验.各组细胞Ki-67表达情况及细胞周期构成比均采用单因素方差分析,组间多重比较采用LSD-t检验,空白对照组与bFGF处理组的两样本比较采用t检验.结果 CCK-8检测表明10 μg/L bFGF对HLE B-3细胞具有促增殖作用,24 h、48 h及72 h的增殖率分别为(18.77±6.53)％、(92.15±8.38)％和(37.09 ±2.89)％.不同浓度NPPB和DIDS在3个时间段内作用细胞后A值的变化表现出剂量及时间依赖性(bFGF+NPPB组:F时间=305.28,F浓度=18.76,P=0.000; bFGF+ DIDS组:F时间=94.43,F浓度=24.41,P=0.000),其中在作用48 h及72 h后,与bFGF处理组比较,各浓度的NPPB和DIDS均使得细胞A值有着明显的下降(P＜0.05).不同浓度的NPPB和DIDS作用于细胞48 h后,细胞内Ki-67蛋白表达细胞数有不同程度下降,差异存在统计学意义(bFGF+ NPPB组:F=580.32,P=0.000;bFGF+ DIDS组:F =507.43,P=0.000),其中150 μmol/L NPPB组和100 μmol/L DIDS组Ki-67的阳性细胞率分别下降至(18.32±1.23)％和(11.21±1.02)％,与bFGF处理组相比较,差异均有统计学意义(P＜0.01,P＜0.01).药物作用48 h后PI染色流式细胞周期检测结果,bFGF组G0/G1期及S期细胞比例分别为(45.35±1.00)％和(31.51±1.04)％,150 μmol/L NPPB组G0/G1期细胞比例升高至(66.53±1.28)％,S期减少至(15.49±1.31)％,100 μmol/L DIDS组G0/G1期细胞比例分别升高至(67.37±0.63)％,S期减少至(13.88±0.53)％,与bFGF组相比差异均存在统计学意义(F=390.75,P=0.000;F=166.24,P=0.000).结论 NPPB和DIDS能够抑制bFGF诱导的HLE B-3细胞增殖,并在G1/S期限制点抑制其进入S期.
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氯通道阻滞剂对N-甲基-D-天冬氨酸诱导离体海马神经元凋亡的保护作用
目的:观察氯通道阻断剂4-乙酰氨基-4'-异氰酸芪-2,2'-二磺酸(SITS)对N-甲基-D-天冬氨酸诱导大鼠离体海马神经元凋亡的保护作用.方法:实验于2004-09/12在南方医科大学神经生物教研室完成.新生1 dSD大鼠64只,无菌断头取双侧海马,胰酶消化,离心,筛网过滤,把神经元种植在96孔或24孔培养板内.取离体培养12 d的神经元,随机分为正常对照组、N-甲基-D-天冬氨酸组、N-甲基-D-天冬氨酸处理时加SITS组和N-甲基-D-天冬氨酸处理后加SITS组.除正常对照组外,其他各组均加入含有N-甲基-D-天冬氨酸300 μmol/L、甘氨酸5μmol/L的培养液,作用10 min后更换培养液,N-甲基-D-天冬氨酸的作用时间是10 min.N-甲基-D-天冬氨酸处理时加SITS组、N-甲基-D-天冬氨酸处理后再加SITS组分别于N-甲基-D-天冬氨酸作用时及作用10 min后使用氯通道阻断剂SITS,SITS的作用终浓度是0.5 mmol/L,作用时间18 h.正常对照组神经元用DMEM/F12培养基换液.18 h后进行Hoechst荧光染色和MTT实验,定量检测神经元凋亡数目和神经元存活率的变化.并对SITS抗凋亡的浓度效应(0-1 000 μmol/L)作以观察.结果:①SITS抗N-甲基-D-天冬氨酸作用的浓度效应:SITS浓度低于100 μmol/L时,保护作用不明显,当浓度达到250、500、1 000 μmol/L时具有明显保护作用(P＜0.05).②神经元细胞核形态的观察:经Hoechst33258染色后,正常神经元的细胞核呈卵圆形,荧光显微镜下呈现均匀的淡蓝色荧光,凋亡的细胞皱缩变圆、染色质浓集或断裂或出现凋亡小体,呈强亮的蓝色荧光,凋亡计数显示,N-甲基-D-天冬氨酸可诱导31.44%左右神经元凋亡,与正常对照组相比差异有显著性(P＜0.05),在N-甲基-D-天冬氨酸作用细胞的同时使用SITS,细胞的凋亡数目减少为19.23%,N-甲基-D-天冬氨酸作用10 min后再使用SITS,细胞的凋亡数目升高为31.64%,两组相比差异有显著性(P＜0.05).③SITS在对N-甲基-D-天冬氨酸处理神经元前后神经元存活率的影响:N-甲基-D-天冬氨酸处理后的细胞存活率明显下降,在N-甲基-D-天冬氨酸作用细胞的同时使用SITS,细胞存活率为93.44%,与对照组相比差异有显著性(P＜0.05);N-甲基-D-天冬氨酸作用10 min后再使用SITS,细胞存活率为73.95%,与N-甲基-D-天冬氨酸处理时加SITS组相比差异有显著性(P＜0.05).结论:SITS作为氯通道阻断剂能抑制N-甲基-D-天冬氨酸诱导的神经元凋亡,对N-甲基-D-天冬氨酸诱导的海马神经元死亡有保护作用,且在N-甲基-D-天冬氨酸处理神经元前后使用作用效果不同,作用机制可能与N-甲基-D-天冬氨酸的效应和氯通道活动均被阻断有关.
关键词： 海马 神经元 凋亡 4-乙酰氨基-4'-异氰酸芪-2 2'-二磺酸 受体 N-甲基-D-天冬氨酸 大鼠
