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氯通道阻滞剂对N-甲基-D-天冬氨酸诱导离体海马神经元凋亡的保护作用
目的:观察氯通道阻断剂4-乙酰氨基-4'-异氰酸芪-2,2'-二磺酸(SITS)对N-甲基-D-天冬氨酸诱导大鼠离体海马神经元凋亡的保护作用.方法:实验于2004-09/12在南方医科大学神经生物教研室完成.新生1 dSD大鼠64只,无菌断头取双侧海马,胰酶消化,离心,筛网过滤,把神经元种植在96孔或24孔培养板内.取离体培养12 d的神经元,随机分为正常对照组、N-甲基-D-天冬氨酸组、N-甲基-D-天冬氨酸处理时加SITS组和N-甲基-D-天冬氨酸处理后加SITS组.除正常对照组外,其他各组均加入含有N-甲基-D-天冬氨酸300 μmol/L、甘氨酸5μmol/L的培养液,作用10 min后更换培养液,N-甲基-D-天冬氨酸的作用时间是10 min.N-甲基-D-天冬氨酸处理时加SITS组、N-甲基-D-天冬氨酸处理后再加SITS组分别于N-甲基-D-天冬氨酸作用时及作用10 min后使用氯通道阻断剂SITS,SITS的作用终浓度是0.5 mmol/L,作用时间18 h.正常对照组神经元用DMEM/F12培养基换液.18 h后进行Hoechst荧光染色和MTT实验,定量检测神经元凋亡数目和神经元存活率的变化.并对SITS抗凋亡的浓度效应(0-1 000 μmol/L)作以观察.结果:①SITS抗N-甲基-D-天冬氨酸作用的浓度效应:SITS浓度低于100 μmol/L时,保护作用不明显,当浓度达到250、500、1 000 μmol/L时具有明显保护作用(P＜0.05).②神经元细胞核形态的观察:经Hoechst33258染色后,正常神经元的细胞核呈卵圆形,荧光显微镜下呈现均匀的淡蓝色荧光,凋亡的细胞皱缩变圆、染色质浓集或断裂或出现凋亡小体,呈强亮的蓝色荧光,凋亡计数显示,N-甲基-D-天冬氨酸可诱导31.44%左右神经元凋亡,与正常对照组相比差异有显著性(P＜0.05),在N-甲基-D-天冬氨酸作用细胞的同时使用SITS,细胞的凋亡数目减少为19.23%,N-甲基-D-天冬氨酸作用10 min后再使用SITS,细胞的凋亡数目升高为31.64%,两组相比差异有显著性(P＜0.05).③SITS在对N-甲基-D-天冬氨酸处理神经元前后神经元存活率的影响:N-甲基-D-天冬氨酸处理后的细胞存活率明显下降,在N-甲基-D-天冬氨酸作用细胞的同时使用SITS,细胞存活率为93.44%,与对照组相比差异有显著性(P＜0.05);N-甲基-D-天冬氨酸作用10 min后再使用SITS,细胞存活率为73.95%,与N-甲基-D-天冬氨酸处理时加SITS组相比差异有显著性(P＜0.05).结论:SITS作为氯通道阻断剂能抑制N-甲基-D-天冬氨酸诱导的神经元凋亡,对N-甲基-D-天冬氨酸诱导的海马神经元死亡有保护作用,且在N-甲基-D-天冬氨酸处理神经元前后使用作用效果不同,作用机制可能与N-甲基-D-天冬氨酸的效应和氯通道活动均被阻断有关.
关键词： 海马 神经元 凋亡 4-乙酰氨基-4'-异氰酸芪-2 2'-二磺酸 受体 N-甲基-D-天冬氨酸 大鼠
