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Wnt-3a对Connexin43及相关基因的表达调控
目的 探讨信号分子Wnt3a蛋白对缝隙连接蛋白43(connexin43)的表达调控作用,以期揭示Wnt3a与connexin43在心脏发育过程中的特定联系与作用.方法 以本室自行构建pCD-NA3.1/wnt-3a真核表达载体转染大鼠心肌细胞系H9c2,在细胞水平通过RT-PCR及Western-blot实验方法研究Wnt-3a对其中Cx43表达及心脏发育相关基因的影响.结果 经转染wnt-3a后,H9c2细胞系中connexin43的表达明显上调,同时与心脏发育相关的GATA4,Nkx2.5基因表达也明显上调.结论 Wnt3a信号通路对connexin43表达存在影响;并可能对心脏发育存在调控作用.
关键词： Wnt-3a Connexin43基因 心脏发育 -
Wnt信号通路对血管内皮细胞血管生成能力的调控
目的:研究Wnt信号通路对血管内皮细胞血管生成能力的调控作用.方法:利用含Wnt-3a分泌性蛋白的大鼠成纤维细胞系Rat-1的上清液作为条件培养液,以体外培养人脐静脉内皮细胞系ECV304,在体外血管新生检测体系(In vitro angiogenesis assay kit)中观察Wnt信号通路激活对ECV304血管生成能力的影响;并用RT-PCR方法对VEGF基因的表达变化进行检测.结果:Wnt-3a条件培养液培养下的ECV304细胞在ECMatrix胶上形成的血管管腔状结构的分支点明显增多(p＜0.05),形成的血管网状结构也比对照组复杂;与对照组相比,Wnt-3a条件培养液培养下的ECV304细胞胞内VEGF基因表达水平未发生明显改变.结论:Wnt信号通路在体外能够促进血管内皮细胞形成新生血管,提高体外血管新生的能力.
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Wnt-1、Wnt-3a和β-catenin在宫颈上皮内瘤变及宫颈鳞癌中的表达及意义
目的：观察细胞外因子wnt-1和wnt-3a及胞质蛋白β-catenin在蛋白水平和基因的表达水平，讨论其在宫颈癌的发生和发展中的作用，为宫颈癌发生和发展的病理机理提供理论依据。方法：利用免疫组化法检验正常宫颈组织12例，宫颈上皮内瘤变组织18例，宫颈鳞癌组织20例中w n t-1、w n t-3a和β-catenin蛋白的表达，并对检测的数据进行数据统计学分析。结果：wnt-3a在正常的宫颈组织、宫颈上皮内瘤变和宫颈鳞癌组织的阳性表达率分别为10%、37.5%和39.3%，三组的数据进行比较可以看到具有显著性差异（p<0.05）。结论：wnt与β-catenin的表达异常与宫颈癌发生和发展具有密切的关系，有可能是进行宫颈癌早期诊断的附加标准，而wnt-3a蛋白与β-catenin蛋白进行联合检测可能会更精确的对宫颈癌早期的早期诊断和对其病理恶性程度进行判断。
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Wnt信号通路对成纤维细胞Rat-1生长及表型的调控
构建Wnt-3a的真核表达载体并稳定转染大鼠成纤维细胞Rat-1,建立Wnt信号通路持续激活的细胞模型,以探讨Wnt信号通路激活对该细胞的生长以及某些表型特征的影响.结果表明:Wnt信号通路持续激活时,Rat-1细胞形态表现为细胞长度的增加,具折光性以及呈绳索状的成束密集排布;MTT以及流式细胞仪检测表明稳定转染后细胞增殖率明显高于正常对照组,进入G2期的细胞增多,细胞增殖分裂能力增强;Transwell小室迁移实验证实转染组的细胞迁移率略高于对照组,但无显著性差异;体外划痕实验表明,稳定转染后的Rat-1细胞在划痕后伤口愈合时间显著缩短.结果提示:体外Wnt信号通路的激活能够引起成纤维细胞某些表型改变,并促进细胞增殖,加速体外伤口的修复.
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Wnt-3a和β-catenin在宫颈上皮内瘤变及宫颈鳞癌中的表达及意义
目的 探讨Wnt-3a蛋白和β-catenin蛋白在正常宫颈组织、宫颈上皮内瘤变(CIN)组织及宫颈鳞癌(SCC)组织中的表达及意义.方法 采用免疫组化SP法检测20例正常宫颈组织(正常组)、24例宫颈上皮内瘤变组织(CIN组)及56例宫颈鳞癌组织(SCC组)中Wnt-3a蛋白和β-catenin蛋白的表达.结果 Wnt-3a和β-catenin在正常宫颈组织、CIN组织及SCC组织中的表达逐渐升高,差异有统计学意义(P<0.01),β-catenin的异常表达与病理分级有关,与临床分期无关,而Wnt-3a与两者均无关.在SCC组织中Wnt-3a与β-catenin的表达有相关性(r=0.181).结论 Wnt-3a和β-catenin可能参与了宫颈鳞状上皮的恶性转化过程,在由CIN发展到SCC的过程中起了一定的促进作用.
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丹龙醒脑方促进脑缺血再灌注损伤大鼠神经干细胞增殖与β-catenin、 Wnt-3a表达及其机制的研究
目的 探究丹龙醒脑方对脑缺血再灌注损伤大鼠海马区内源性神经干细胞增殖与β-catenin、Wnt-3a表达的影响.方法 将60只雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组、依达拉奉组(西药组)、丹龙醒脑方小剂量组(丹小组)、丹龙醒脑方大剂量组(丹大组),线栓法制备局灶性脑缺血再灌注(I/R)损伤模型,再灌注7d后取大鼠缺血侧脑组织.采用BrdU掺入法记录海马齿状回颗粒下区BrdU阳性细胞数目;采用RT-qPCR法检测海马总β-catenin、Wnt-3a mRNA表达;采用Western Blot法检测海马总β-catenin、胞浆β-catenin、Wnt-3a蛋白表达.结果 与假手术组比较,其余各组BrdU阳性细胞数、β-catenin、Wnt-3a蛋白及mRNA的表达明显增强,差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01);与模型组比较,西药组、丹小组、丹大组BrdU阳性细胞数、β-catenin、Wnt-3a蛋白及mRNA表达明显增强,差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01).结论 丹龙醒脑方可能通过激活β-catenin及Wnt-3a表达促进神经干细胞增殖.
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Wnt-3a/eGFP双表达基因慢病毒载体的构建及其在大鼠骨髓间充质干细胞中的表达
目的 构建双表达基因慢病毒载体pLV.EX3d.P/puro-EF 1A＞Wnt-3a＞IRES/eGFP,用携带目的基因Wnt-3a及示踪基因增强型绿色荧光蛋白(eGFP)的慢病毒转导大鼠骨髓间充质干细胞(rat Bone marrow mesenchymal stem cells,rBMSCs),建立能够持续激活Wnt信号通路的体外细胞模型.方法 基于GatewayTM技术构建双表达基因慢病毒载体,经293FT包装并释放出病毒转导rBMSCs,检测Wnt-3a以及β-catenin的表达水平.结果 经测序证实目的基因Wnt-3a及示踪基因eGFP片段按正确方向重组入目的载体中.用含Wnt-3a/eGFP的病毒上清转导rBMSCs,转导率超过85％.RT-PCR证实rBMSCs-Wnt3a过表达wnt-3a和β-catenin.结论 携带目的基因Wnt-3a及示踪基因eGFP的慢病毒可以稳定转染rBMSCs,构建了能够持续激活Wnt信号通路的体外细胞模型.
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小鼠Wnt-3a基因在NIH3T3细胞中的表达及其活性的初步分析
目的:表达具备生物活性的重组小鼠Wnt-3a信号蛋白.方法:应用脂质体转染试剂将重组真核表达载体pSecTag2/Hygro B-Wnt3a转染并筛选稳定表达的NIH3T3细胞,Western Blot鉴定重组Wnt-3a蛋白的表达,并对Wnt3a/NIH3T3细胞的融合密度及抗凋亡能力给予检测.结果:Wnt-3a信号蛋白在Wnt3a/NIH3T3细胞中获得稳定表达,Wnt-3a信号蛋白能够明显提高NIH3T3细胞的融合密度及抗凋亡能力.结论:在NIH3T3细胞中表达的重组Wnt-3a信号蛋白具备生物活性.
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小鼠Wnt-3a基因的克隆、测序与真核表达载体的构建
1 材料和方法1.1 材料 KM小鼠,孕13.5 d,安徽省实验动物中心提供. 大肠杆菌JM109由安徽医科大学分子生物学教研室提供. Trizol试剂盒、pSecTag2/Hygro B质粒(Invitrogen). 质粒小量提取试剂盒、 RT-PCR试剂盒(Promega);Ex Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶,DNA Marker, pMD18-T Vector,限制性内切酶(TaKaRa).
