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SD大鼠胚胎体外培养及TALEN质粒内源活性检测的研究
目的 建立Sprague-Dawley (SD)大鼠1-细胞胚胎体外培养体系,并用于TALEN质粒内源活性检测.方法 超排4～6周龄雌鼠,取0.5 dpc雌鼠受精卵.将构建的TALEN质粒体外转录为mRNA后显微注射于受精卵胞质中,将注射成功的受精卵培养于mR2ECM培养液中.巢式PCR扩增目的基因,送测序检测TALEN质粒的敲除效率.结果取出的1-细胞胚胎在mR2ECM培养液中大程度能发育到8-细胞胚胎;培养液的pH值影响了胚胎的发育程度,过滤前pH值7.18±0.12的培养液,胚胎8细胞发育率较高.本研究送检三批显微注射后体外培养的胚胎,检测结果表明胚胎发育至4细胞以上时,mRNA已经能够充分表达和发挥敲除作用,TALEN质粒的敲除效率为(9.3±2.8)％.结论 建立SD大鼠l-细胞胚胎体外培养的体系,且将其成功应用于TALEN质粒内源活性检测.
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利用TALEN技术制备HE4(WFDC2)敲除小鼠模型
目的 利用显微注射技术和TALEN技术构建HE4(WFDC2)敲除小鼠并对其进行表型分析.方法 设计Wfdc2敲除位点,构建TALEN载体,体外转录TALENs获得mRNA并通过显微注射技术注射到C57BL/6 J小鼠受精卵,对F0代小鼠进行DNA鉴定获得HE4(WFDC2)敲除小鼠,观察并统计HE4(WFDC2)敲除小鼠出生及存活情况.结果 在Wfdc2第一个外显子上设计了TALEN识别剪切位点,向受精卵注射TALENs mRNA获得了24只F0代小鼠,其中1只发生移码突变,成功制备了HE4(WFDC2)敲除小鼠,并发现纯合HE4敲除小鼠出生后在短时间内致死.结论 通过TALEN技术成功制备HE4(WFDC2)敲除小鼠,纯合HE4(WFDC2)敲除小鼠出生致死.
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斑马鱼 uba6和 uba7突变体的构建与鉴定
目的：构建斑马鱼uba6和uba7突变体。方法运用TALEN技术在斑马鱼uba6和uba7基因编码区引进突变，并测序鉴定突变类型。结果成功获得了两种突变类型的uba6和三种突变类型的uba7斑马鱼突变体。结论成功构建了斑马鱼uba6和uba7突变体，为进一步研究斑马鱼uba6和uba7基因的功能提供了材料。
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利用 TALEN 技术高效制备 TXNIP 基因敲除小鼠模型
目的：利用显微注射技术注射敲除Txnip基因的TALEN mRNA获得TXNIP敲除小鼠。方法在线设计Txnip敲除位点，构建TALEN载体并在细胞水平验证剪切活性，体外转录TALENs成mRNA并通过显微注射技术注射到C57BL／6J小鼠受精卵，对F0代小鼠进行DNA水平鉴定获得TXNIP敲除小鼠。结果在Txnip第一外显子上设计了TALEN识别剪切位点，并在细胞水平验证具有剪切活性，注射mRNA到受精卵获得了4只敲除小鼠，其中2只Txnip发生移码突变，成功制备了TXNIP敲除小鼠。结论通过注射TALENs mRNA可以高效制备TXNIP敲除小鼠。
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TALEN构建Fndc5基因敲除小鼠及初步分析
目的：通过构建Fndc5基因敲除小鼠，为后续的研究提供动物模型。方法运用TALEN技术在Fndc5基因FNIII domain中造成缺失突变，并通过测序进行基因型鉴定。通过配对建立稳定遗传系并在mRNA和DNA水平鉴定出生小鼠基因型；对不同年龄段出生小鼠进行体重、血糖分析；通过qPCR确定Fndc5在肾脏、肝脏、大脑、肌肉、心脏等组织中的表达情况。结果成功构建并鉴定得到4种不同的Fndc5基因敲除小鼠品系；不同年龄段出生小鼠体重、血糖未见显著性差异；确定Fndc5在肌肉、心脏等组织中高表达。结论本实验在国际上成功构建了Fndc5基因敲除小鼠，并进行了初步分析，为深入研究Fndc5基因在体内中的功能提供了动物模型。
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应用 TALEN 技术敲除 gata4基因建立斑马鱼先天性心脏病模型
目的：人工构建TALEN靶向敲除载体敲除gata4基因，建立斑马鱼先天性心脏病动物模型。方法采用单元组装法构建靶向敲除gata4基因的载体，将其体外转录成TALEN mRNAs，通过显微注射的方式注入单细胞期受精卵中，胚胎检测TALEN的敲除效率，再通过剪尾、酶切、测序筛选发生基因突变的斑马鱼及突变的类型。结果酶切、测序结果证实成功构建出正确的 gata4靶向敲除载体，注入斑马鱼受精卵中，发生基因敲除的效率为35．18％，通过剪尾、PCR、酶切检测成功地筛选出了发生基因突变的斑马鱼，测序结果显示出不同种类的gata4基因突变。结论成功构建gata4基因敲除的斑马鱼动物模型，为进一步研究人类gata4基因突变引起先天性心脏病的发病机制提供了良好的动物模型。
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TALEs:识别DNA的有力工具
植物致病菌黄单胞杆菌可以产生一种通过一连串的重复单元特异识别并激活植物基因启动子的蛋白-TALEs.TALEs与DNA识别的关键在于2个连续的多态性氨基酸可以组成1个TALE-DNA结合密码,每个密码特异结合1个核苷酸.整个TALEs蛋白与双链DNA结合,其重复单元的顺序决定了可以结合的核苷酸序列.用人工设计的TALE核酸酶(TALENs)可以对包括植物、昆虫和哺乳动物在内的广泛的物种进行目的基因的编辑;而且人工设计的TALEs也可以与不同的功能结构融合,起到包括激活和调节基因表达在内的广泛作用,因此为生物技术和基因治疗方面提供了一个良好的工具.
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TALEN靶向敲除REST对U-87细胞增殖和迁移的影响
目的 研究TALEN(transcription activator-like effector nuclease)靶向敲除REST(repressor element 1-silencing transcription factor)对U-87细胞增殖和迁移能力的影响.方法 使用分子克隆手段构建TALEN质粒;通过western blot分析TALEN打靶效率;分别使用CCk-8法和Transwell小室法检测细胞增殖和迁移能力.结果 TALEN能够有效打靶U-87细胞中的REST,蛋白水平显著下调;TALEN靶向敲除REST能够显著降低U-87细胞的增殖和迁移水平.结论 TALEN能够高效打靶U-87细胞中的REST,进而抑制U-87细胞的增殖和迁移能力.
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SIRT6对肝细胞脂质合成的影响及其转录基因分析
目的:在肝脏L-02 SIRT6-KO细胞系中,观察SIRT6在肝脏脂滴形成中的作用,初步研究在肝脏脂质代谢中SIRT6相关的转录差异基因发挥作用的分子机制.方法:利用基因敲除技术TALEN技术,构建肝脏L-02 SIRT6特异性敲除细胞系,并经qPCR和Western blot检测其表达水平;利用油酸刺激L-02 SIRT6-KO细胞及其对照组,体外模拟肝脏脂肪变的条件,并经高内涵和油红染色验证其脂滴形成能力;利用基因芯片检测L-02 SIRT6-KO及其对照细胞系中相关差异基因,并经生物信息学分析筛选脂代谢相关差异基因.结果:建立人肝脏SIRT6特异性敲除细胞系,qPCR显示mRNA下降50％,但Western blot证明SIRT6完全敲除;BODIPY实验及油红O染色发现,L-02 SIRT6-KO细胞比对照组其脂滴形成数量增多,高内涵荧光检测显示L-02 SIRT6-KO细胞中脂滴荧光强度比对照组增强(176.38±2.55 vs 104.26+ 2.08);通过对差异转录基因分析,发现了一组在脂质代谢中和SIRT6相关的关键基因如STEAP4、HMGA2、PDE1A、INSL4等.结论:成功建立人肝脏L-02 SIRT6-KO细胞系,并经实验证明SIRT6缺失能够促进脂滴形成;筛选到一组和SIRT6相关参与脂质代谢的关键基因.
关键词： TALEN L-02 SIRT6-KO 脂质代谢 差异转录基因 -
TALEN介导的Betatrophin敲除HepG2细胞株的建立
目的:构建新基因Betatrophin敲除HepG2细胞株,为研究该基因功能提供模型细胞.方法:构建的Betatrophin TALEN质粒转入HepG2细胞,通过T7E1酶切确定打靶效率高达50％以上,并通过测序筛选出Betatrophin双基因敲除的单克隆细胞,Western blot进一步证实Betatrophin基因表达完全沉默.结果:通过TALEN打靶获得了Betatrophin双基因敲除的HepG2细胞株.结论:Betatrophin双基因敲除HepG2细胞株的建立为后期进一步研究Betatrophin在肝细胞中调控糖代谢和改善胰岛素抵抗作用机制奠定基础.
关键词： TALEN Betatrophin HepG2细胞株 基因打靶 -
SD大鼠超排及TALEN质粒显微注射构建基因敲除大鼠
目的 应用TALEN技术构建基因敲除大鼠,并探讨SD大鼠超数排卵、显微注射浓度、胚胎移植方式对构建大鼠出生率、阳性率的影响.方法 将SD雌鼠超数排卵后,取受精卵显微注射由TALEN质粒体外转录成的mRNA,注射后存活的受精卵输卵管移植,观察大鼠的出生率,并测序判定出生大鼠的基因敲除阳性率.结果 4～5周和5～6周的雌鼠超数排卵见栓率[(74±9)％vs(77±6％)％]、取卵数量[(25±2)枚vs (23±2)枚]以及卵的受精率[(85±2)％vs(93±2)％]差异均无统计学意义(P＞0.05);结扎公鼠和受体雌鼠在8～10周时见栓率高[(23.02±5.26％)％],使用12周后见栓率明显下降[(11.66±2.40)％];单侧和双侧输卵管移植大鼠出生率差异无统计学意义(37.88％ vs 36.49％),但单侧移植大鼠存活率高于双侧移植(37.88％ vs 20.27％,P＜0.05),且单细胞移植大鼠出生率显著高于双细胞移植.质粒注射浓度在20 ng/μl组大鼠基因敲除阳性率高(7.5％).结论 应用TALEN技术成功构建基因敲除大鼠,显微注射质粒浓度20 ng/μl时大鼠出生率不受影响且基因敲除阳性率高.
关键词： Sprague-Dawley大鼠 TALEN 显微注射 敲除
