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免疫缺陷小鼠体内人源化骨髓微环境的重建
目的:通过在免疫缺陷小鼠体内重建人源的骨髓微环境,为进一步研究人异常的骨髓微环境在人白血病发生发展中的作用提供模型.方法:通过反复冻融浓缩后血小板获得人血小板裂解液(HPL),以α-MEM作为基础培养液分别添加10％ HPL和10％胎牛血清(FBS)培养骨髓来源的间充质干细胞.比较两种添加成分对MSC形态、免疫表型、多向分化能力以及增殖能力的影响;将HPL培养的MSC接种于β-TCP支架材料并移植到免疫缺陷小鼠背部皮下,8-12周后取出移植体做HE染色,观察MSC在体内形成骨以及骨髓结构的能力.结果:用HPL和FBS培养的MSC均呈现长梭形纤维样细胞结构,均具有多向分化能力;两种体系培养的MSC免疫表型无明显区别,但用人血小板裂解液培养的MSC具有更强的增殖能力和向成骨分化能力;用人血小板裂解液培养的MSC具有在体内形成骨组织样结构的能力.结论:HPL培养的MSC具有更强的增殖能力以及成骨分化潜能,它能在NOD/SCID鼠上重建人源化骨髓微环境.
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Mg-Mn-Zn合金介导成骨作用研究
目的：：建立Mg-Mn-Zn合金介导的成骨作用模型，为进一步研究体内成骨机制奠定基础。方法：一月龄雄性SD大鼠12只，麻醉后股骨干穿通性钻孔造成骨创伤，植入Mg-Mn-Zn合金介导棒，同时注入庆大霉素预防感染，每周皮下注射钙黄绿素。术后5、9、18、26周分别随机处死3只大鼠，取出植入有介导金属棒的股骨，各组材料经体视显微镜、光镜、扫描电镜、倒置荧光显微镜观察并行能量色散谱元素分析，岛津EPMA1610电子探针显微分析仪测试样品内镁、钙、磷元素分布。结果：体视镜及光镜观察见5、9、18、26周髓腔中金属移植物周围包裹有新生骨，倒置荧光显微镜观察见移植物周围有新骨生成。能量色散谱元素分析表明含有碳、氧元素的基底膜层在金属移植物周围形成。电子探针显微分析表明介导金属棒周围与成骨作用有关的钙、磷元素丰富。结论：成功的制作了Mg-Mn-Zn合金介导的体内成骨作用模型。结论：Mg-Mn-Zn合金能够很好的介导体内成骨。
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小鼠骨髓基质成纤维细胞与成骨关系的实验研究
目的:研究骨髓基质成纤维细胞与成骨的关系.方法:Luria多器官培养器体外器官培养法、肾被膜下移植技术以及石蜡切片技术.结果:移植物在移植处形成软骨细胞团及骨基质.结论:骨髓基质成纤维细胞集落形成细胞(CFU-F)为基质多能干细胞,能增生分化为成骨所必需的基质细胞.
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骨髓CFU－F体内、体外成骨功能研究
目的：研究骨髓基质成纤维细胞与成骨的关系，为临床应用奠定基础。方法：采用Liuria多器官培养器体外器官培养法、肾被膜下移植技术以及石蜡切片技术、Gomori染色和Von Kossa染色技术。结果：移植物在肾被膜下形成软骨细胞团及骨基质；在β－GP存在下，骨髓基质CFU－F体外培养可见形成钙化的骨板。结论：骨髓基质CFU－F为基质多能干细胞，能增生分化为成骨以及造血诱导微环境所必需的各种基质细胞系。
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兔下颌骨来源骨髓间充质干细胞生物学行为及其体内成骨的研究
目的:探讨兔下颌骨来源的骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)体外分离、培养及其生物学行为,评价下颌骨BMMSCs体内成骨的效果.方法:取兔下颌骨中的松质骨,贴壁培养,取第P2或P3代检测:1)倒置显微镜下观察细胞生长状态；2)MTT法测定细胞增殖并绘制细胞生长曲线；3)向成骨细胞和脂肪细胞诱导分化；4)将P3代BMMSCs与羟基磷灰石/磷酸三钙(Hydroxyapatite/tricalcium phosphate,HA/TCP)复合,自体回植；单纯HA/TCP植入做对照.术后8周和20周,通过组织学观察评价体内成骨的效果.结果:1)细胞经传代后形态一致；2)细胞生长曲线显示下颌骨BMMSCs经历潜伏期、对数生长期和平台期；3)成骨诱导、成脂诱导后形成钙结节及脂滴,茜素红、油红O染色呈阳性；4)体内成骨显示术后8周BMMSCs-HA/TCP组空隙内新骨形成；术后20周大量新骨形成,HA/TCP大部已降解.单纯HA/TCP植入组术后8周未见新骨形成；20周大部HA/TCP降解,仍未见新骨形成.结论:兔下颌骨分离出的BMMSCs,具有强大的自我复制、增殖能力及多向诱导分化的潜能,并能体内成骨.
关键词： 下颌骨 间充质干细胞 生物学行为 体内成骨 羟基磷灰石/磷酸三钙 -
成骨生长肽
成骨生长肽(Osteogenic Growth Peptide,简称OGP)是一种促进体外成骨细胞增殖和体内成骨的多肽类物质.它初是从损伤后再生的骨髓的培养基质中分离纯化而来.经过近十年的研究,目前对它的来源、理化特性、生物学活性有了初步的了解.
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海藻酸钠凝胶复合异种骨构建组织工程骨及体内成骨
目的 采用海藻酸钠凝胶(sodium alginate,A)复合异种骨的方法,构建骨组织工程载体,观察载体中细胞的生物性能及体内成骨能力,为构建效率更高的骨组织工程载体提供实验依据.方法 取2只2周龄新西兰兔的骨髓,以rhBMP-2(1×10-8mol/L)诱导培养BMSCs.取诱导后第2代BMSCs接种于1%(V/W)A中,培养4 d HE染色观察凝胶中细胞形态.将第2代BMSCs分为单纯DMEM凝胶组和含1%A的DMEM凝胶组,培养7 d后行BMP-2免疫组织化学染色观察.第2代BMSCs与2%(V/W)A的DMEM凝胶混合,负压下复合去抗原牛松质骨(xenograftbone,X),4 d后扫描电镜观察细胞生长情况.取24只裸鼠,随机分为2组(n=12),于两侧股部肌袋中分别植入BMSCs-A-X复合体作为实验组,BMSCs-X复合体作为对照组.于术后2、4周后组织学观察复合体成骨情况,图像分析系统分析各组成骨或软骨的面积百分比.结果 HE 染色观察,培养4 dA中BMSCs细胞形态饱满,细胞悬浮于凝胶中,可见细胞分裂和核分裂相.单纯DMEM凝胶组和含1%A的DMEM凝胶组免疫组织化学观察,细胞分裂增殖正常,伸出多种形态的突起,胞核大,核仁清晰.单纯DMEM凝胶组BMP-2表达阳性率为44.10%4±3.02%;含1%A的DMEM凝胶组为42.40%±4.83%,差异无统计学意义(P>0.05).扫描电镜观察:A均匀复合于X微孔中,不同平面均有细胞生长.植入裸鼠体内2周后,实验组及对照组中均有软骨和骨组织形成;实验组软骨面积百分比为7.31%±0.32%,骨为516%±0.24%;对照组软骨为2.31%±0.21%,骨为2.16%±0.22%;两组差异有统计学意义(P<0.05).术后4周,两组软骨和新生骨小梁及骨髓组织较2周时增多;实验组软骨面积百分比为9.31%±0.31%,骨为7.26%±0.26%;对照组软骨为3.31%±0.26%,骨为2.26%±0.28%;两组差异有统计学意义(P<0.05).术后2、4周同组间比较差异有统计学意义(P<0.05).结论 以A-X构建骨组织工程载体,符合组织工程载体的超结构原理,大限度地承载细胞,生物性能好,对BMSCs增殖和成骨表型及相关的生物性能无不良影响,在体内成骨效率较高.
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兔成骨细胞体外培养及自体肌内成骨的实验研究
目的:建立一种体外培养兔成骨细胞的生物学模型,并对其生物学特性及体内成骨能力进行研究.方法:抽取日本大耳白兔骨髓液经离心后得骨髓单个核细胞,以1×106/ml的细胞浓度进行培养,经传代培养,通过倒置显微镜、 HE染色、扫描电镜、透射电镜、碱磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色、Ⅰ型胶原免疫组化染色和Von Kossa钙染色等手段对获得的细胞进行生物学特性研究.然后将细胞与载体材料-膨体聚四氟乙烯(ePTFe)复合培 1周后回植自体兔肌肉内,4周、8周后分别取材,组织学方法观察其成骨能力.结果:培养的细胞形态多样,呈集落样生长,可相互重叠成复层状,胞浆富含线粒体、粗面内质网和高尔基体,胞浆突起长短、粗细不等,互相连接.培养细胞富含ALP活性Ⅰ型胶原和Von Kossa染色均阳性.这与典型成骨细胞的生物学特性相似.成骨细胞经体外增殖,与载体复合培养后生长良好.植入体内早期(4周时)形成的骨基质结构疏松,周围仍有较多成骨细胞,晚期(8周时)则可见形成的骨样组织结构致密,内有骨细胞位于骨陷窝中,与典型的骨组织结构相似.结论:用兔骨髓基质细胞在体外筛选、培养成骨细胞的方法是可行的.
