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红细胞裂解液对CD34+细胞相对计数的影响
为了研究红细胞裂解液对CD34+细胞相对计数结果的影响,对37份外周血干细胞采集物进行CD34-PE及CD45-FITC双色免疫荧光染色后用FACS裂解液(FACSTM lysing solution,FACS)、IOTest(R)3裂解液(IOTest(R)3lysing solution,IOTest)及自配裂解液溶解红细胞,采用洗涤程序和运用ISHAGE设门策略,检测CD34+细胞相对数,同时记录细胞的前向散射(forward scatter,FSC)、侧向散射(side scatter,SSC)信号及CD45+细胞百分比.结果表明,FACS处理的样本CD34+细胞百分比低于IOTest(0.50±0.42vs0.92±0.59,p=0.004);而IOTest与自配红细胞裂解液处理结果的差异无统计学意义(0.92±0.59vs0.95±0.64,p=0.902).经IOTest裂解后细胞的FSC、SSC信号均显著高于FACS(p＜0.01).IOTest裂解后的样本CD45+细胞百分比低于FACS.WBC数的多少与CD34+细胞百分比不存在相关关系(rs=0.192,p=0.357).结论:某些红细胞裂解液对CD34等抗原阳性细胞的相对计数确有不良影响,用流式细胞术检测或计数时应慎重选择红细胞裂解液.
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运用甘油磷酸氧化酶法测定冰冻红细胞解冻后残留甘油的含量
目的 建立测定冰冻红细胞解冻洗涤后残留甘油含量的酶学方法测定工艺.方法 进行甘油磷酸氧化酶法的线性范围测定、重复性、准确性(回收试验)、游离血红蛋白干扰试验,并比较不同样本处理方法(钨酸钠裂解法、三氯醋酸裂解法及制备后2h直接取上清液法)对酶法检测甘油的影响;进行系列浓度甘油红细胞酶法测定结果与传统过碘酸钠滴定法测定结果比对.结果 用GPO-PAP法检测甘油浓度在0.05～2.0 g/L时有较好的线性关系,,=0.9994,Y=0.942 X+0.0239;甘油含量为0.2 g/L、1.0 g/L的样本,批内CV值分别为2.68％、0.81％(n=20),日间CV值分别为4.59％、4.37％(n=20);甘油浓度从0.29～2.09 g/L间其回收率97.1％～100.8％,样本的平均回收率为99.0％;10g/L游离血红蛋白对GPO-PAP法检测结果无干扰;3种样本处理方法所测得的系列浓度甘油红细胞样品及解冻去甘油红细胞制品(n=18)酶法测定结果一致(P＞0.05);系列浓度甘油红细胞测定结果显示酶法测定比滴定法更准确,滴定法测定值偏高.结论 甘油磷酸氧化酶法可用于冰冻解冻去甘油红细胞制品中残留甘油含量的测定,方法简便、快速、准确、重复性好.3种样本处理方法对GPO-PAP法检测甘油含量无影响.
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红细胞裂解液法体外分离培养兔骨髓间充质干细胞
背景：有研究向骨髓液中加入红细胞裂解液来提高分离纯化骨髓间充质干细胞的效率，以期获得纯度高、数量多的骨髓间充质干细胞。
目的：进一步验证红细胞裂解液法体外分离纯化兔骨髓间充质干细胞的增殖特性，并对其进行细胞生物学鉴定。
方法：使用红细胞裂解液提取含有兔骨髓间充质干细胞的骨髓悬混液，于4，7，10，13 d记录比较原代细胞的生长相对数量；观察传代细胞的生长情况，绘出 P2、P3、P4及P5代细胞的生长曲线，比较各代细胞的增殖特点；倒置相差显微镜观察细胞的形态，细胞免疫荧光及流式细胞仪检测所获得细胞的CD44、CD34表面抗原的表达情况。
结果与结论：红细胞裂解液法所获得的兔骨髓间充质干细胞为均一规则的以梭形为主的贴壁细胞，其胞核胞核均质、核仁明显、胞浆丰富，且CD44抗原表达阳性、CD34抗原表达阴性；原代细胞生长曲线呈类“S”型；P4代细胞具有较好的增殖活性，其生长速度、所获取的细胞数量均优于其他代数细胞。说明红细胞裂解液法可以在体外较好的培养出骨髓间充质干细胞，其P4代细胞是骨髓间充质干细胞增殖能力强的一代细胞。 -
人肺癌抗原对脐血细胞生物学特性的影响
我们采用红细胞裂解液制备脐血有核细胞,方法简便,成本低廉,细胞回收效率高,为进一步提高脐血的临床应用领域,我们采用人肺癌抗原刺激脐血有核细胞,观察其对脐血有核细胞凋亡、细胞周期、集落形成能力的影响,以探讨其临床应用的可行性.
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不同方法分离人脐血造血细胞的比较研究
目的:比较不同方法分离人脐血造血细胞的回收率.方法:分别用甲基纤维素、明胶、羟乙基淀粉、红细胞裂解液分离脐血造血细胞,计算有核细胞回收率.Giemsa染色计算单个核细胞百分率.结果:4种方法分离后回收率分别为66.13%、74.91%、66.13%、62.90%.结论:4种方法效果均较好,其中以明胶分离效果佳.
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高效液相色谱法测定人红细胞中巯基嘌呤甲基转移酶的活性
目的:建立一种改良的高效液相色谱法测定人红细胞中巯基嘌呤甲基转移酶(thiopurine methyltransferase, TPMT)的活性.方法:采用反相高效液相色谱法直接测定酶促反应的产物6-甲基巯基嘌呤的浓度,从而计算红细胞中TPMT的活性.以6-巯基嘌呤为底物,S-腺苷-L-甲硫氨酸作为甲基供体,红细胞裂解液在一定的条件下进行孵化,然后经乙酸乙酯萃取处理后,用HPLC分析.色谱柱为hypersil BDS C18,流动相为水-甲醇-三乙胺(磷酸调至pH 3.5)(76.8∶23∶0.2),紫外检测波长为 290 nm.结果:6-甲基巯基嘌呤在 10～200 μg/L 范围内呈良好的线性关系,相关系数r=0.9994,[JP2]低检测限为 3 μg/L(S/N=3),平均回收率为 86%～94%.我们运用该法测定了273例健康中国成年人红细胞中TPMT的活性,其平均活性为(11.96±3.27)nmol/h·ml Packed RBC,男性和女性的平均TPMT活性分别为(12.08±3.38)nmol/h·ml Packed RBC和(11.73±3.07)nmol/h·ml Packed RBC,两者无显著性差异.结论:本分析方法具有灵敏准确,重复性好,安全可靠,易于推广等特点,能满足巯基嘌呤类药物药代动力学研究和临床用药监测的要求.
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红细胞预处理对小鼠脾组织P物质蛋白条带表达的影响
目的 针对蛋白质印迹技术难以检测常规方法处理后的脾组织中的P物质(SP)蛋白,探讨更佳的脾组织处理方法.方法 小鼠颈椎脱臼处死,取脑组织测质量后进行粉碎,离心弃上清液,按照1∶10(W∶V)的比例加入细胞组织快速放射免疫沉淀裂解液和蛋白酶抑制剂混合物,裂解30 min后进行提取.脾组织蛋白按照以下3种方法进行提取:(1)采取与脑组织蛋白提取方法一致的常规方法进行提取;(2)脾组织预先采用胶原酶Ⅰ进行消化,用红细胞裂解液裂解和Hank's液洗涤处理后再进行蛋白提取;(3)脾组织不进行Hank's液洗涤,其他步骤均与第2种方法一致.后所有组织均按相同步骤进行蛋白质印迹技术检测,观察SP蛋白表达水平.结果 用常规方法提取后,脑组织总蛋白中SP蛋白条带表达明显,脾组织总蛋白中未检测到SP蛋白条带.脾组织用红细胞裂解液处理后提取的总蛋白中SP蛋白表达条带较为明显,但有非特异性条带.脾组织用红细胞裂解液和Hank's液洗涤处理后提取的总蛋白中SP蛋白条带表达明显,无非特异性条带.结论 用红细胞裂解液和Hank's液预处理小鼠脾组织,可排除红细胞的干扰,提高其蛋白提取率,有利于P物质在蛋白质印迹技术中的条带表达.
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利用流式监控高质量小鼠脾细胞的制备
目的 流式技术监控小鼠脾细胞裂解过程,在确保脾淋巴细胞高活力的同时,充分裂解其中的红细胞.方法 以流式细胞术监控ACK和Tris-NH4Cl两种红细胞裂解液的裂解效果,通过细胞融合率判断淋巴细胞活力.结果 结合FSC和PI荧光强度分析,在确保淋巴细胞相对存活率大于或等于90%的前提下,ACK处理0.5～1 min即可去除90%以上的红细胞,Tris-NH4Cl处理10 min也可去除82%的红细胞,获得的淋巴细胞的融合效率为85%～90%.结论 流式细胞术能够实时监控ACK和Tris-NH4Cl的裂解过程,获得高质量的脾淋巴细胞以适用于杂交瘤细胞的制备.
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结核分枝杆菌标本的不同处理方法对PCR扩增敏感性的影响
目的探讨检测标本中血红蛋白(Hb)浓度对PCR扩增管中Taq酶活性的影响及消除影响的方法;探讨胰酶消化痰液的应用价值;比较淋巴细胞分离液、红细胞裂解液、十二烷基硫酸钠(SDS)溶血液处理全血标本对检测结果敏感性的影响;观察SDS在结核分枝杆菌DNA(TB DNA)提取液中存在的价值及对Taq酶的影响.方法将经梯度稀释的Hb标准品与结核分枝杆菌(TB)定值质控品混匀制备成待检标本进行PCR检测;将定值Hb标准品与TB质控品混匀制备成待检标本,观察提取时100℃煮沸时间对Hb抑制Taq酶能力的影响;将结核患者的痰液分成两管,分别用4 g/dl NaOH消化、1 g/dl胰酶消化、1 g/dl胰酶消化+4 g/dl NaOH处理,比较PCR检测结果的敏感性;将结核患者的外周抗凝血分别用淋巴细胞分离液、红细胞裂解液、SDS溶血剂处理,比较PCR检测结果的敏感性;用10 g/LSDS、1%(v/v)Triton、1 g/LSDS的1%(v/v)Triton、0.5 g/L SDS的1%(v/v)Triton提取液对相同的TB质控品进行TB DNA提取,观察PCR检测结果敏感性;56份痰液、34份全血按痰液、全血标本的方法处理,进行PCR扩增,比较检测结果的阳性率.结果当Hb≥10-5g/L时,Hb对Taq酶的抑制作用随其浓度的增加而增强;提取时100℃煮沸40 min与煮沸10 min的对照管结果完全一致;痰液标本处理方法的敏感性顺序为:胰酶消化+NaOH处理＞胰酶消化＞NaOH消化;全血标本处理方法的敏感性顺序为:红细胞裂解液法=淋巴细胞分离法＞SDS溶血法;提取方法PCR检测结果敏感性顺序为:0.5 g/L SDS的1%(v/v)Triton＞1%(v/v)Triton＞1 g/L SDS的1%(v/v)Triton＞10 g/L SDS,SDS对Taq酶的抑制作用随其浓度的增加而增强.56份痰标本按上述方法处理的阳性率分别为57.1%(32/56),82.1%(46/56),91.0%(51/56),通过配对资料卡方检验,胰酶消化和胰酶消化+NaOH处理与NaOH消化法之间具有显著性差异(P＜0.005),胰酶消化和胰酶消化+NaOH处理之间差异无显著性(0.1＜P＜0.25);34份全血标本按上述方法处理的阳性率分别为79.4%(27/34),79.4%(27/34),47.0%(16/34),通过配对资料卡方检验,红细胞裂解液法和淋巴细胞分离法与SDS溶血法之间具有显著性差异(0.005＜P＜0.01).结论检测TB DNA标本的预处理有必要规范化.
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一种简易检测人红细胞中6-硫鸟嘌呤浓度的HPLC法
目的:建立一种简易的反相高效液相色谱法检测人红细胞中6-硫鸟嘌呤的浓度.方法:以焦性没食子酸为内标,用70%高氯酸沉淀红细胞裂解液中的蛋白质,上清液在100 ℃水浴45 min后,用HPLC分析.色谱柱为Hypersil BDS C18 ,流动相为水-乙腈-三乙胺(磷酸调至pH 3.2)(99∶0.8∶0.2),流速为1.0 mL*min-1,紫外检测波长为340 nm,进样量为20 μL.结果:6-硫鸟嘌呤低检测限为0.02 mg·L-1(S/N=3),线性范围在0.025～1 mg·L-1,标准曲线回归方程Y=0.108 5X+0.004 11(r=0.999 9),平均回收率为96.0%～105.5%.结论:本测定方法简便快速,可满足6-硫鸟嘌呤和6-巯基嘌呤药代动力学研究和临床监测的要求.
