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神经生长因子促进海马胆碱能神经再生过程中Lhx8的动态表达
目的探讨神经生长因子（ NGF）促进海马胆碱能神经再生与同源盒基因Lhx8之间的关系。方法SD大鼠72只，在制备切割右侧穹隆海马伞模型和NGF侧脑室注射的基础上，分为对照组、切割组、NGF组、切割联合NGF组；Real-time PCR和Western blotting分别检测各组动物海马中Lhx8蛋白的表达变化；免疫荧光技术检测各组动物海马齿状回颗粒下层中胆碱乙酰转移酶（ ChAT ）/Lhx8双标细胞数。结果切割组和NGF组中Lhx8蛋白的表达量较对照组增高，切割联合NGF组增高更为明显，且Lhx8基因表达也增高；NGF组和切割联合NGF组中海马齿状回颗粒下层（ SGZ）中的ChAT/Lhx8双标细胞数也较对照组和切割组明显增多。结论侧脑室注射NGF促进海马胆碱能神经再生与Lhx8的高表达有关。
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Lhx8促进海马神经干细胞向胆碱能神经元分化
目的 构建大鼠Lhx8全长结构基因真核表达载体.方法 PCR法扩增Lhx8全长结构基因,经EcoRI和BamHI双酶切后连接至真核表达载体pEGFP-C3中,重组质粒pEGFP-C3-Lhx8经测序鉴定后,采用脂质体转染的方法转染至体外培养的海马神经干细胞中.结果 测序鉴定表明,重组质粒pEGFP-C3-Lhx8-EGFP构建成功,该重组质粒转入体外培养的神经干细胞后,质粒转染组中ChAT阳性的细胞数较阴性对照组明显增多(P＜0.05).结论 重组质粒pEGFP-C3-Lhx8-EGFP构建成功,Lhx8能够促进NSCs向ChAT阳性的细胞分化.
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Lhx8在海马胆碱能神经再生中的作用
目的 探讨切割穹隆海马伞大鼠海马胆碱能神经再生过程中Lhx8的作用.方法 72只SD大鼠随机分成4组,每组18只.所分的4组分别为:对照组(未做任何处理),切割组(切割右侧穹隆海马伞),过表达组(右侧海马齿状回中注射Lenti6.3-Lhx8慢病毒)及切割联合过表达组(右侧海马齿状回中注射Lenti6.3-Lhx8慢病毒并切割右侧穹隆海马伞).28d后每组各取6只分别制备脑冷冻切片行免疫荧光检测,提取海马总RNA行Real-time PCR,提取海马蛋白行Western blotting检测.结果 与对照组相比,切割组、过表达组和切割联合过表达组中Lhx8 mRNA和蛋白水平均显著上调,以切割联合过表达组中上调为显著,组间比较差异均有统计学意义;切割组胆碱乙酰转移酶(ChAT) mRNA水平与对照组相比无统计学差异,过表达组和切割联合过表达组中ChATmRNA显著上调,且以切割联合过表达组中上调为显著;切割组、过表达组和切割联合过表达组中均检测到ChAT蛋白,组间比较差异有统计学意义;切割组、过表达组和切割联合过表达组海马齿状回门区和颗粒下层中均能检测到新生的Lhx8阳性的胆碱能神经元,且以切割联合过表达组多,组间比较差异均有统计学意义.结论 上调Lhx8的表达能促进海马中神经干细胞向胆碱能神经元分化,Lhx8可能与海马胆碱能神经再生有关.
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切割穹窿海马伞大鼠海马内Lhx8 mRNA表达的变化
目的:探讨切割穹窿海马伞大鼠切割侧与正常侧海马内Lhx8 mRNA表达的差异.方法:切割SD大鼠右侧穹窿海马伞.切割后7d制备海马冰冻切片,用体外转录法制备地高辛标记的Lhx8 RNA探针进行原位杂交,分析切割侧和正常侧海马锥体细胞层和齿状回颗粒层中及齿状回门区和颗粒下层中的Lhx8 mRNA阳性细胞的数量和平均光密度值.结果:切割侧和正常侧海马锥体细胞层和齿状回颗粒层Lhx8 mRNA阳性细胞数量无明显差异,但切割侧平均光密度值较正常侧明显增加;在齿状回的门区和颗粒下层,切割侧Lhx8 mRNA阳性细胞数和平均光密度值均较正常侧升高.结论:切割穹窿海马伞后海马中Lhx8 mRNA表达上调,可能与其中的神经干细胞向胆碱能神经元分化的神经再生机制有关.
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慢病毒介导的Lhx8基因过表达在海马胆碱能神经元发生中所起作用的初步研究
目的：明确Lhx8过表达慢病毒在海马齿状回胆碱能神经元发生中的作用。方法：构建Lhx8过表达重组质粒、进行慢病毒包装，通过颅脑立体定位和微量注射的方法，将所得慢病毒Lenti6.3-Lhx8注入SD大鼠海马齿状回中；于注射后第1、3、7、10、14天在激光共聚焦显微镜下直接观察增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein， EGFP)的荧光表达；检测术后第7天时EGFP/Lhx8/ChAT三标阳性细胞的数目。结果：慢病毒注射后第3天，海马齿状回中 EGFP绿色荧光信号强；此后EGFP表达下降，注射后第14天，几乎检测不到EGFP阳性细胞；术后第7天，注射Lenti6.3-Lhx8的慢病毒侧海马齿状回门区内能够检测到EGFP/Lhx8/ChAT三标阳性细胞，与阴性对照侧比较明显增多。结论：海马齿状回内注射Lhx8过表达慢病毒能够促进胆碱能神经元的发生。
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RT-PCR检测穹窿海马伞切割后大鼠海马内Lhx8 mRNA的表达变化
目的:探讨切割穹隆海马伞大鼠海马与正常海马内Lhx8 mRNA表达的差异.方法:36只SD大鼠随机分成6组.每组6只.1组为正常对照组,其余5组分别为切割穹窿海马伞后3、7、14、21和28d组.取各组大鼠的海马组织,提取总RNA,采用半定量RT-PCR法分析穹隆海马伞切割后海马内Lhx8 mRNA的表达变化.结果:海马内Lhx8mRNA的表达量在切割后第3d开始升高,7d时达到高水平,以后逐渐下降,于28d时恢复至正常水平.结论:切割穹窿海马伞后海马中Lhx8 mRNA表达的增高可能与神经干细胞向胆碱能神经元分化的再生机制有关.
关键词： 穹窿海马伞切割 海马 Lhx8 逆转录-聚合酶链反应 大鼠 -
Lhx8基因沉默抑制NGF诱导的海马NSCs向胆碱能神经元分化的研究
目的:明确Lhx8在神经生长因子(nerve growth factors,NGF)促进海马神经干细胞向胆碱能神经元分化中的作用.方法:体外培养海马神经干细胞并应用NGF促进其向胆碱能神经元分化的过程中,将构建的Lhx8干扰慢病毒加入至培养液中,7d后应用免疫荧光标记技术检测分化所得胆碱乙酰转移酶(choline acetyltransferase,ChAT)和微管相关蛋白-2(microtubule-associated protein 2,MAP-2)双标阳性细胞.结果:在空白对照组中,仅检测到少量的ChAT/MAP-2双标阳性细胞;在NGF组或是NGF联合阴性对照慢病毒组中则可检测到较多的ChAT/MAP-2双标阳性细胞;在加入Lhx8干扰慢病毒的实验组中,分化所得的ChAT/MAP-2双标阳性细胞数较NGF组或是NGF联合阴性慢病毒组明显减少.结论:Lhx8基因沉默抑制了NGF诱导的海马神经干细胞向胆碱能神经元的分化.
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切割穹窿海马伞后海马齿状回内Lhx8的表达变化及其对RGCs向胆碱能神经元分化的影响
目的:明确Lhx8在SD大鼠切割穹窿海马伞后海马齿状回颗粒下层和门区中的表达变化.方法:切割SD大鼠穹窿海马伞,成功制备海马去神经支配动物模型后,通过Western Blot的方法检测切割后第1、3、7、14、21、28 d海马中Lhx8蛋白的表达变化;通过免疫组织化学方法检测切割后第7天海马齿状回颗粒下层和门区中Lhx8阳性细胞的表达定位,并通过免疫荧光化学方法检测Lhx8/ChAT双标阳性细胞的共定位情况;切割SD大鼠穹窿海马伞并制备海马提取液,将其加入至细胞培养液中,模拟体内海马神经再生微环境,检测培养的海马放射状胶质细胞(radial slia cells,RGCs)向胆碱能神经元分化的情况.结果:切割穹窿海马伞后第7d,Lhx8蛋白表达量较其他各时相点明显增高;海马齿状回颗粒下层和门区中Lhx8阳性细胞数目和光密度也明显高于正常侧,Lhx8/ChAT双标阳性细胞数目也较正常侧增多;体外细胞培养,切割穹窿海马伞侧海马提取液也较正常侧海马提取液更能促进海马放射状胶质细胞向胆碱能神经元的分化.结论:切割穹窿海马伞后,Lhx8表达明显上调,与海马齿状回的胆碱能神经再生有关.
