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Akt/mTOR信号通路在海人酸损伤大鼠海马组织中的激活
目的 研究Akt/mTOR信号通路在海人酸(KA)诱导的大鼠海马神经元损伤中的激活和HIF1α的表达情况.方法 成年SD大鼠随机分为3组,其中2组接受脑室注射,1组为假手术组.大鼠麻醉后颅骨钻孔但侧脑室注射KA 1.0μg(KA组)或等体积生理盐水(NS组)或相应位置颅骨钻孔但不予注射(假手术组).8和16 h及1、3和5 d后,用Western blot观察Akt和mTOR的表达及其磷酸化水平,用免疫组化观察HIF1α的表达情况.结果 尼氏染色显示,KA组大鼠海马CA3区1 d时即开始有死亡,5 d时累及CA1区.Akt在KA损伤16 h后就开始激活并持续至第5天;mTOR于第1天开始激活,第3天时达峰值.CA3区的HIF1α于第1天明显升高,CA1区的HIF1α表达则于3 d时明显升高.NS组和假手术组上述各指标变化均不明显.结论 KA诱导激活大鼠海马中Akt/mTOR通路,可能调节神经元的存活.
关键词： 海人酸 Akt/mTOR通路 HIF1α 大鼠 -
罗格列酮对骨髓瘤细胞HIF1α和IGF1mRNA表达的影响及其可能机制
目的 观察罗格列酮作用后骨髓瘤细胞HIF1α和IGF1 mRNA表达水平,探讨罗格列酮抑制骨髓瘤血管形成的可能机制.方法 以骨髓瘤细胞系RPMI 8226细胞及5例初诊多发性骨髓瘤患者骨髓浆细胞(CD138免疫磁珠筛选,作为骨髓瘤原代细胞)为研究对象,采用RT-PCR法检测用不同浓度(10、20、40 μmol/L)罗格列酮处理前后骨髓瘤细胞HIF1α、IGF1 mRNA表达水平;采用Westernblot法检测AKT和ERK蛋白磷酸化和非磷酸化表达的情况.同时以5例缺铁性贫血患者的骨髓单个核细胞为对照组.结果 RPMI8226细胞和骨髓瘤原代细胞HIF1α和IGF1 mRNA表达显著高于对照组.罗格列酮浓度为20 μmol/L处理48 h后,与对照组相比,RPMI 8226细胞中HIF1α、IGF1 mRNA相对表达水平分别由1.21±0.08和0.62±0.06降至0.75±0.06和0.32±0.04,骨髓瘤原代细胞中HIF1α、IGF1mRNA表达水平分别由2.02±0.16和1.92±0.13降至0.53±0.04和0.58±0.03,差异均有统计学意义(P值均＜0.05),且呈剂量依赖性;10、20、40 μmol/L罗格列酮均可抑制RPMI8226细胞pAKT、pERK蛋白的表达,然而对骨髓瘤原代细胞T-AKT和T-ERK蛋白表达没有明显影响.结论 罗格列酮可抑制HIF1α、IGF1 mRNA的表达,降低pAKT和pERK蛋白的表达可能是其抑制肿瘤血管形成机制之一.
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miR-34b抑制非小细胞肺癌A549的侵袭和迁移
目的:本研究旨在探索miR-34b对非小细胞肺癌A549侵袭和迁移的影响及HIF1α在其中所起的作用.方法:A549细胞转染miR-34b mimic和pc-HIF1α过表达载体以过表达miR-34b和缺氧诱导因子-1α (HIF1α).A549细胞分为4组:A549(空对照)组,miR-34b mimic组,pc-HIF1α组和miR-34b mimic+pc-HIF1α组.实时定量PCR (qRT-PCR)检测miR-34b表达和HIF1α的mRNA水平.荧光素酶分析验证miR-34b和HIF1α的靶向关系.蛋白印迹检测HIF1α、基质金属蛋白酶2(MMP-2),Snail和血管内皮细胞生长因子(VEGF)的蛋白水平.Transwell分析细胞侵袭.划痕实验检测细胞迁移.结果:转染miR-34b mimic可提高A549细胞miR-34b的表达水平,降低HIF1α的mRNA水平(P＜0.001).miR-34b可直接靶向HIF1α.miR-34b过表达可抑制pc-HIF1α诱导的HIF1α蛋白水平升高(P＜0.01).与对照组相比,miR-34b过表达可显著降低细胞侵袭数目和愈合率(P＜0.01).此外,miR-34b过表达可显著抑制HIF1α过表达导致的细胞侵袭和愈合率增加(P＜0.01).miR-34b mimic组MMP-2、Snail和VEGF相对蛋白水平低于对照组(P＜0.01).pc-HIF1α组MMP-2、Snail和VEGF相对蛋白水平高于对照组(P＜0.01).与pc-HIF1α组相比,miR-34b mimic+pc-HIF1 α组MMP-2、Snail和VEGF相对蛋白水平下降(P＜0.01).结论:miR-34b-5p过表达通过靶向HIF1α抑制非小细胞肺癌A549的侵袭和迁移.
关键词： 肺癌 miR-34b-5p 侵袭 迁移 HIF1α -
UVB辐射角质形成细胞表达低氧诱导因子(HIF1α)初步探讨
目的 研究紫外线(UVB)辐射对人永生化角质形成细胞(HaCaT)表达HIF1α的影响.方法 体外培养HaCaT,不同剂量的UVB辐射,在照射后不同时间收集细胞,Western blot测定HIF1α蛋白含量.Realtime-PCR测定细胞中HIF1αmRNA含量.结果 UVB可增强HIF1α蛋白表达,并呈剂量依赖性和时间依赖性.UVB照射不改变HIF1αmRNA表达.结论 UVB辐射可促进HaCaT细胞表达HIF1α.
关键词： 紫外线(UVB) 人永生化角质形成细胞 HIF1α -
抑制 HIF1α表达对低氧培养 SGC-7901胃癌细胞CD44表达的影响
目的：研究低氧条件下胃癌细胞HIF1α及CD44的表达变化，并观察下调HIF1α表达对CD44表达的影响。方法以人胃癌细胞系SGC7901细胞为研究对象，分别于正常氧压及含1％ O2条件下传代培养1周。随后加入20 nm／L雷帕霉素培养72 h，CCK8法检测细胞活力，Transwell试验检测细胞侵袭能力，实时定量PCR及western blot检测CD44及HIF1α的mRNA及蛋白表达。结果与正常组对比，低氧条件下细胞增殖活性明显升高（P＜0．05），侵袭活性明显增强（P＜0．05），HIF1α及CD44基因的mRNA及蛋白表达水平明显升高（P＜0．01）。雷帕霉素处理后，不论在常氧及低氧条件下细胞活力均较对照组弱（P＜0．05），细胞侵袭活性明显下降（P＜0．05）。细胞HIF1α和CD44的mRNA及蛋白表达水平均明显降低（P＜0．01）。结论低氧条件下胃癌细胞SGC7901增殖及侵袭能力明显增强，下调细胞的HIF1α表达后，显著降低CD44的表达。由此可推测，低氧可能通过HIF1α调节CD44的表达，调控胃癌细胞增殖及侵袭潜能。
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SYBR Green实时定量PCR检测胰腺癌中HIF1α、VEGF和bFGF的表达及其临床意义
目的:研究胰腺癌及癌旁组织中HIF-1α、VEGF和bFGF mRNA的表达情况及其临床意义.方法:利用实时荧光定量聚合酶链反应技术对22例胰腺癌细胞及其对应的癌旁组织中HIF-1α、VEGF和bFGF mRNA进行定量检测,并分析其与临床病理特点之间的关系.结果:统计结果显示HIF-1α、VEGF和bFGF在胰腺癌中的表达高于癌旁组织(P<0.01),相关性分析显示肿瘤组织中HIF-lα表达与VEGF、bFGF表达呈显著正相关(P<0.01).HIF-1α表达与肿瘤大小和淋巴结转移显著相关(P<0.01),与TNM分期有关(P<0.05),与性别、年龄无相关性,VEGF表达与肿瘤大小和淋巴转移相关(P<0.05),bFGF高表达与肿瘤大小、淋巴转移淋巴转移相关(P<0.05),而与TNM分期、性别及年龄无相关性.结论:HIF-1α、VEGF和bFGF在胰腺癌中存在高表达,HIF-1α表达与TNM分期、肿瘤大小和淋巴转移相关,VEGF和bFGF表达与肿瘤大小和淋巴转移相关.实时荧光定量PCR检测HIF-1α、VEGF和bFGF对评估胰腺癌患者预后可能有一定的价值,也为胰腺癌的治疗提供了治疗靶点.
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HIF1α特异性人源喉癌噬菌体单链抗体的制备及其对放疗增敏的实验研究
目的 利用噬菌体肽库技术,构建HIF1 α人源喉癌单链抗体(single-chain variable fragment,scFv),研究其对放疗敏感性的影响.方法 提取喉癌患者癌旁阳性淋巴结总RNA,通过RT-PCR和重叠延伸PCR扩增得到可变区基因scFv,将其重组到载体pCANTAB5E中,转化至TG1大肠杆菌,以制备初级抗体库.以HEP2细胞及HIF1α纯化抗原对抗体库进行淘选.SDS-PAGE电泳检测scFv的可溶性表达,Western blot检测其对HIF1α蛋白表达的影响,ELISA和细胞免疫化学鉴定其特异性,CCK-8检测scFv联合X线照射后HEP2细胞的存活率,克隆形成实验分析scFv处理后HEP2细胞放疗存活曲线.结果 成功制备HIF1α人源喉癌单链抗体scFv,SDS-PAGE电泳证实其可溶性表达且相对分子质量约为34×103,Western blot表明其能下调HIF1α蛋白的表达.ELISA检测到该抗体对HIF1α抗原的识别率高达79％,细胞免疫化学显示该抗体与HEP2细胞特异性结合.CCK-8检测结果显示scFv联合X线照射后,较单纯X线照射组明显降低了HEP2细胞的存活率(P＜0.05),克隆形成实验结果显示scFv对放射的增敏比为1.89.结论 成功构建了HIF1α人源喉癌单链抗体,且其能增加HEP2细胞对放疗的敏感性.
关键词： 噬菌体单链抗体scFv 喉癌 HIF1α 放疗增敏 -
慢病毒载体介导HIF1α稳定表达A549细胞系构建
目的 利用慢病毒载体系统构建稳定表达HIF1α的A549细胞系.方法 以NCBI人HIF1α基因编码序列为模板,设计并合成引物,PCR法扩增HIF1α.酶切回收的HIF1α片段与制备的慢病毒载体HBLV-RFP-Puro重组反应.PCR和基因测序鉴定重组质粒.重组质粒和辅助质粒共转染293T细胞.包装好的病毒经过滤、浓缩后,利用稀释计数法测定病毒滴度.制备好的慢病毒感染A549细胞,采用药物筛选稳定转染细胞系.荧光显微镜及Western blot检测观察转染及筛选效果.结果 PCR扩增HIF1α片段经鉴定成功,重组质粒经PCR、基因测序鉴定构建成功.成功包装获得高滴度LV-HIF1α.LV-HIF1α感染A549细胞后经药物筛选,荧光显微镜下细胞带有红色荧光,Western blot结果显示LV-HIF1α组HIF1α的表达水平明显高于对照组.结论 慢病毒载体介导HIF1α稳定表达的A549细胞系构建成功.
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HIF-1α与P300/CBP在肺鳞癌和肺腺癌中的表达及意义
目的:探讨缺氧诱导因子(HIF-1α)和P300/CBP在肺鳞癌和肺腺癌中的表达及其与分型、分化、转移的关系.方法:采用免疫组织化学(SP)法检测60例肺鳞癌和肺腺癌组织中HIF-1α及P300/CBP的表达.结果:HIF-1α蛋白表达的阳性率在癌组织中为48.33%,显著高于正常支气管黏膜组织(P<0.01),P300/CBP的表达与肿瘤的分化程度、淋巴结转移和患者吸烟与否显著相关,但与年龄性别无关,肺鳞癌和肺腺癌组织中HIF-1α表达与P300/CBP表达呈显著负相关(P<0.01).结论:肺鳞癌和肺腺癌组织中HIF-1α蛋白表达与靶蛋白P300/CBP蛋白降解有关,提示HIF-1α蛋白过表达在肺癌的发生和发展中起重要作用.
