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脂肝泰胶囊对高脂血症性脂肪肝大鼠肝细胞凋亡及相关基因蛋白表达的影响
目的:探讨脂肝泰胶囊治疗高脂血症性脂肪肝的作用机制.方法:采用高脂饮食喂饲大鼠复制脂肪肝模型,以东宝肝泰为对照药,观察各组大鼠肝脏病理形态学变化,并运用流式细胞仪观察各组大鼠肝细胞凋亡及相关基因蛋白bcl-2和bax表达的变化.结果:HE染色镜下可见模型组大鼠肝脏中度以上脂肪变性,并有少量的肝细胞坏死;流式细胞术分析可见其细胞凋亡率为13.3%,bcl-2表达量降低,bax表达量增高.与模型组比较,各用药组肝脂变程度显著改善,肝细胞的凋亡率明显下降(P＜0.05或P＜0.01),bcl-2基因表达量增高(P＜0.05),bax基因表达量降低(P＜0.05).结论:脂肝泰胶囊能使bcl-2蛋白表达上调、bax蛋白表达下降,抑制细胞凋亡趋势,以达到抗脂肪肝作用.
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补肾中药对下丘脑GnRH、垂体FSH、LH及成骨细胞BGP基因表达的调节作用
探讨补肾中药对下丘脑促性腺激素释放激素(GnRH)、腺垂体促性腺激素卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)及成骨细胞骨钙素(BGP)基因表达的调节作用。方法:采用定量的逆转录-聚合酶链式反应(定量的RT-PCR)方法，观察青春期大白鼠喂饲滋阴泻火或益肾填精中药后，下丘脑GnRH、腺垂体FSH、LH及成骨细胞BGP的信使核糖核酸(mRNA)表达水平的变化。结果:滋阴泻火药可使下丘脑GnRH、腺垂体FSH、LH及成骨细胞BGP的mRNA表达水平显著下调,而益肾填精药可使下丘脑GnRH、腺垂体FSH、LH及成骨细胞BGP的mRNA表达水平显著上调。结论:说明补肾中药可在转录水平调节下丘脑GnRH、腺垂体FSH、LH及成骨细胞BGP基因表达，这可能是补肾中药调整性早熟患儿青春发育进程和改善骨骼发育的主要作用机理之一。
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应用抑制消减杂交研究惊恐致肾虚及金匮肾气丸治疗后小鼠的差异表达基因
背景:中药金匮肾气丸能改善肾虚症状,但其分子机制还不清楚.目的:用抑制消减杂交技术观察惊恐致肾虚及中药金匮肾气丸治疗后小鼠的差异表达基因.设计:随机对照动物实验.单位:成都中医药大学中医遗传学研究室,四川大学生命科学学院分子生物学与生物技术四川省重点实验室.材料:实验在成都中医药大学实验动物中心进行.取BALB/c雄性成年小鼠30只,单纯随机分为模型组、药物治疗组和对照组3组,每组10只小鼠.方法:模型组和药物治疗组小鼠应用"恐伤肾"法和悬吊应激法制备肾虚鼠模型.药物治疗组小鼠每天灌服金匮肾气丸(北京同仁堂制药厂生产,由桂枝、附子、熟地、山药、山茱萸、泽泻、茯苓、丹皮等组成)1次,给药剂量按成人用药量的20倍.造模及给药时间总共为14 d.对照组小鼠自然生长,不施加任何外界刺激.后一次给药后24 h,3组小鼠均取血100μL,应用SMART技术反转录并扩增以获取各组小鼠血液的全长总cDNA;运用正向和反向抑制消减杂交技术获得正反两个方向、3种状态下(肾虚、治疗后以及正常生理状态)的6组差异表达cDNA片段.主要观察指标:金匮肾气丸对肾虚小鼠基因表达的影响.结果:①各组均有差异表达的cDNA片段;中药治疗后,肾虚小鼠的差异基因表达谱有向正常生理状态下接近的趋势;用同一种cDNA作为抑制消减杂交的tester和driver,同源片段全部被消减掉,消减效率较高.②获得了6个cDNA文库.结论:惊恐所致肾虚与一些基因的差异表达相关,而中药金匮肾气丸能影响这种改变,使其差异表达基因谱趋近于正常生理状态.
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ADP-核糖基化因子拮抗剂对人视网膜血管内皮细胞形成血管管腔的抑制作用及其机制
背景 研究证实ADP-核糖基化因子(ARF)能促进角膜组织中促血管相关因子的分泌,如血管内皮生长因子(VEGF)和一氧化氮合酶(NOS)等,从而导致病理状态下角膜新生血管的发生,但ARF对人视网膜膜血管内皮细胞(HRECs)管腔形成能力的影响和机制尚不清楚,了解ARF对HRECs形成管腔能力的影响对研究视网膜新生血管相关疾病的靶向治疗具有重要意义.目的 探讨ARF拮抗剂对HRECs管腔形成能力的影响以及其作用机制.方法 对HRECs进行常规培养和传代,取对数生长期细胞分为对照组和ARF拮抗剂组,对照组细胞在实验过程中按常规培养法培养,培养基中不添加ARF拮抗剂,而ARF拮抗剂组细胞在后续实验时于培养液中添加15 μmol/L的ARF拮抗剂1 ml.采用逆转录PCR法和Western blot法检测ARF mRNA及蛋白在HRECs中的表达.应用半固态Matrigel胶体外三维成型法检测对照组和ARF拮抗剂组HRECs形成管腔形态和数目.采用RT-PCR和Western blot法检测VEGF、NOS、局部黏着斑激酶(FAK)、热休克蛋白90(HSP90) mRNA及蛋白在各组HRECs中的相对表达量.结果 逆转录PCR和Western blot法检测显示,对照组和ARF拮抗剂组HRECs中ARF mRNA的相对表达量分别为0.65士0.14和0.32±0.10,对照组和ARF拮抗剂组HRECs中ARF蛋白的相对表达量分别为0.85±0.15和0.24±0.17,ARF拮抗剂组ARFmRNA及其蛋白的相对表达量均明显低于对照组,差异均有统计学意义(t=7.32,P=0.00;t=5.15,P=0.00).对照组和ARF拮抗剂组HRECs形成管腔的数量分别为(51.46±7.12)和(34.66±8.57)个/视野,差异有统计学意义(t=2.99,P=0.04).RT-PCR和Western blot法检测显示,ARF拮抗剂组HRECs中VEGFmRNA和NOS mRNA及蛋白的相对表达量均明显低于对照组,差异均有统计学意义(t=3.02,P=0.04;t=3.68,P=0.02;t=3.33,P=0.03;t=2.89,P=0.04).ARF拮抗剂组HRECs中FAK mRNA和HSP90 mRNA的相对表达量分别为0.65±0.18和0.28±0.05,均明显低于对照组中0.76±0.25和0.46±0.09,差异均有统计学意义(均P＜0.05).结论 ARF拮抗剂对HRECs的管腔形成能力有抑制作用,其作用机制可能与下调VEGF、NOS和下游重要信号转导因子FAK、HSP90在HRECs中的表达有关.
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姜黄素对人胚胎干细胞向视网膜色素上皮样细胞定向诱导效率的促进作用
背景 来源于多能干细胞的视网膜色素上皮(RPE)细胞移植治疗年龄相关性黄斑变性(AMD)和视网膜色素变性(RP)是近年研究热点,但RPE体外分化诱导效率低下、成本高等一直是难以克服的障碍.研究表明,姜黄素(curcumin)可促进人胚胎干细胞(ESCs)的定向诱导分化,但其对人ESCs向RPE样细胞的定向分化的作用机制尚不清楚. 目的 研究体外培养的人ESCs向视网膜色素上皮(RPE)样细胞的诱导分化过程,探讨curcumin对人ESCs向RPE细胞定向诱导效率的影响及其机制. 方法 将人ESCs株进行体外培养,将处于对数生长期的ESCs传代至基质膜(Matrigel)包被的6孔板中,以mTeSRTM1培养基培养至过渡融合状态后更换为含质量分数87％ KnockOutTM DMEM、质量分数10％血清替代物(SR)、质量分数1％非必需氨基酸和质量分数1％谷氨酰胺及青链霉素双抗的分化诱导体系,同时加入终浓度为1 μmol/L的curcumin处理24 h,对照组培养基中未加入curcumin.分别于诱导培养3周及5周时提取细胞RNA及蛋白,采用荧光定量逆转录PCR(RT-PCR)法检测诱导RPE(iRPE)细胞中干细胞标志物、RPE相关标志物及Wnt/β-catenin信号通路相关因子mRNA的相对表达水平;采用Western blot法及免疫荧光染色检测人ESCs、iRPE细胞及人RPE细胞中相关标志物蛋白的表达水平;通过细胞吞噬实验检测iRPE细胞的吞噬功能. 结果 Curcumin组诱导后3周时即可见iRPE细胞色素化,随着时间延长色素化程度更高,而对照组细胞在诱导后5周时开始出现细胞色素化.RT-PCR结果显示,curcumin诱导后3周及5周,curcumin组iRPE细胞中ESCs标志物NANOG mRNA的相对表达水平明显低于对照组,差异均有统计学意义(t=13.086,P=0.022;t=34.186,P=0.004),而RPE标志物Pax6、RX、CRALBP及RPE65 mRNA的相对表达量明显高于对照组,差异均有统计学意义(均P＜0.01).Western blot检测显示,CRALBP、RPE65和MITF蛋白在iRPE细胞中表达,表达强度与人RPE细胞相近,而人ESCs不表达上述蛋白.免疫荧光染色显示,iRPE细胞中Pax6、MITF和ZO-1蛋白表达阳性,分别定位于细胞质和细胞膜,可见curcumin组得到的细胞为iRPE细胞,纯化效率达到100％,体外细胞吞噬实验显示,iRPE细胞的细胞质内呈现的聚苯乙烯荧光微球接近阳性对照组,而阴性对照组iRPE细胞中未见到聚苯乙烯荧光微球.诱导培养后第3周和第5周时,curcumin组细胞中Wnt信号通路下游靶因子Lef1、MYC和TCF7,Wnt受体FZD3及Wnt配体Wnt2B和Wnt7B的mRNA相对表达水平明显高于对照组,差异均有统计学意义(均P＜0.01). 结论 Curcumin能提高人ESCs向RPE样细胞的定向诱导效率,其主要机制可能是通过促进Wnt/β-catenin信号通路的活性,从而促进iRPE细胞的分化和成熟.
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γ-干扰素对肝癌细胞株Hep-G2 Fas,Bcl-2表达的影响
目的观察γ-干扰素(γ-IFN)对肝癌细胞株Hep-G2细胞(Hep-G2)表达Fas，Bcl-2的影响。方法应用γ-IFN预处理Hep-G2,用阿霉素诱导凋亡，MTT法分析细胞死亡率，电镜观察凋亡，免疫组织化学法研究γ-IFN作用于Hepp-G2细胞过程中Fas，Bcl-2的表达情况。结果γ-IFN预处理的Hep-G2表达Fas增强，表达Bcl-2减弱(P<0.05)；γ-IFN预处理后Hep-G2细胞对阿霉素的敏感性提高(P<0.05)。结论γ-IFN对肝癌细胞株Hep-G2 Fas，Bcl-2表达有影响，并可提高肝癌细胞对阿霉素的敏感性。
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活血化瘀经典方剂对小鼠大肠癌肝转移模型端粒酶及p53、c-erbB-2、Bcl-2基因表达的影响
目的观察活血化瘀方药对恶性肿瘤转移的影响并探讨其作用机制.方法建立小鼠结肠癌cT-26细胞脾移植肝转移模型并应用活血化瘀代表方抵当汤、桂枝茯苓丸和丹参饮,观察实验组与对照组小鼠肝癌端粒酶、P53、C-erbB-2和Bcl-2蛋白的表达情况.结果各组动物接种瘤细胞后均发生了不同程度的肿瘤转移情况.抵当汤、桂枝茯苓丸组与对病理对照组端粒酶、P53、C-erbB-2和Bcl-2蛋白的表达有显著性差异,丹参饮与病理对照组端粒酶的表达有显著性差异,但癌基因的表达没有显著性差异.结论抵当汤和桂枝茯苓丸对大肠癌肝转移模型端粒酶和癌基因蛋白表达有抑制作用,丹参饮可抑制端粒酶的表达,对癌基因的表达没有抑制作用.这可能是活血化瘀方剂抑制肿瘤转移的机制之一,且活血化瘀的力度可能与抑制肿瘤转移的效果有关.
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葡萄糖神经酰胺合酶基因在多药耐药肿瘤细胞株KBV200的表达及其与肿瘤多药耐药性的关系
目的观察葡萄糖神经酰胺合酶(glucosylceramide synthase,GCS)基因在人口腔表皮样癌多药耐药细胞株KBV200的表达及其与肿瘤多药耐药性(MDR)的关系.方法采用RT-PCR分析KBV200及其亲本KB细胞株GCS基因表达的差异,运用MTT法分析KBV200经糖脂合成酶抑制剂苯基棕榈酰胺吗啡丙醇(DL-PPMP)及钙离子通道阻滞剂异搏定处理前后细胞MDR的变化,应用RT-PCR技术检测KBV200细胞耐药逆转后GCS及mdr1基因的表达.结果KBV200细胞GCS和mdr1基因的表达明显强于KB细胞,而KB细胞mdr1基因表达为阴性.5～25μmol/L DL-PPMP均可抑制KBV200GCSmRNA表达,25μmol/L时抑制强度大;10μmol/L异搏定即可抑制KBV200GCS mRNA表达,15μmol/L时抑制作用明显.DL-PPMP和异搏定均可抑制mdr1基因的表达,KBV200经25 μmol/LDL-PPMP作用48 h后细胞内mdr1表达为阴性.结论异搏定和DL-PPMP对GCS和mdr1基因表达的抑制调节呈浓度依赖性,它们可通过抑制GCS和mdr1基因表达,逆转KBV200对长春新碱的耐药.KBV200GCS基因的表达与MDR存在正相关,GCS基因可能在肿瘤的多药耐药过程中起着重要作用.
关键词： 基因表达/药物作用 肿瘤多药耐药 葡萄糖神经酰胺合酶基因 异搏定
