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清热解毒药对组分调控巨噬细胞M1/M2表型及其机制研究
考察清热解毒药对白花蛇舌草-半枝莲的组分(YDW11)对巨噬细胞表型M1/M2的调控及其机制.利用脂多糖(1ipopolysaceharides,LPS)/干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)和白介素4(interleukin 4,IL-4)/白介素13(interleukin 13,IL-13)分别诱导鼠源巨噬细胞RAW264.7为M1和M2表型,MTT法检测YDW 11对细胞活力的影响;Griess反应法检测细胞上清液中亚硝酸盐含量的变化;Trans-well小室迁移实验考察M2型巨噬细胞对乳腺癌细胞4T1的体外迁移及YDW11干预的影响;qRT-PCR法检测YDW11对细胞内诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)、白介素1β(interleukin1β,1L-1β)、精氨酸酶1(arginase-1,Arg-1)、甘露糖受体(mannose receptor,MR)基因表达的影响;Western blot法检测YDW11对iNOS和Arg-1蛋白表达的影响;Taqman microRNA RT-PCR法检测YDW11对miR155表达的影响.质谱(MS)联用超高效液相色谱(UPLC)检测YDW11中的化学成分.结果显示,等比水提取白花蛇舌草-半枝莲药对的乙酸乙酯组分(YDW11)呈剂量依赖性抑制巨噬细胞M1表型中亚硝酸盐含量,同时抑制M2型巨噬细胞引起的乳腺癌细胞4T1体外迁移加剧,且对未刺激的巨噬细胞M0无细胞毒性.YDW11呈剂量依赖性抑制M1表型标记物iNOS和M2表型标记物Arg-1基因及蛋白的表达,抑制M1表型中IL-1β和M2表型中MR的基因表达,调控M1表型上升而M2表型下调的miR155的表达.MS-UPLC联用结果显示,YDW11中含有对羟基苯乙酮、野黄芩苷、木犀草素和芹菜素4种化学成分.结果表明,YDW11部分通过调控miR155的表达,抑制巨噬细胞M1和M2表型标志性产物iNOS和Arg-1的基因和蛋白表达,而调控巨噬细胞M1/M2表型的极化过程.
关键词： 白花蛇舌草-半枝莲药对 巨噬细胞表型 miR155 -
创伤环境巨噬细胞表型的时空相关性及其对生物材料支架引导组织再生与修复的意义
炎症反应是机体对损伤和异物的正常应答,炎症的强度和持续时间影响生物材料在体内的相容性和稳定性.巨噬细胞是调控机体免疫和炎症反应的重要细胞,因此它对生物材料的响应性在认知材料-机体反应中有决定性作用.系统阐述巨噬细胞表型与机体创伤环境及对后期的修复和(或)再生、巨噬细胞表型与相关生物材料之间的相互作用,并对其未来发展方向进行评述.
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巨噬细胞表型在鼠疫杆菌和牛布鲁氏杆菌联合免疫效果早期评价中的潜在作用
目的 在需要多种疫苗同时免疫的应急情况下,如何快速评价联合免疫的效果是目前迫切需要解决的问题.本研究旨在探究巨噬细胞表型变化在早期快速评价鼠疫杆菌和布氏杆菌联合免疫效果中的潜在作用及其可能的应用价值.方法 建立鼠疫杆菌、牛布鲁氏杆菌疫苗小鼠免疫模型,分别在免疫早期(4 d)和免疫后期(14 d)检测巨噬细胞表型(M1或M2极化)差异,及CD8+T细胞表型功能的变化,分析早期巨噬细胞免疫表型对后期CD8+T细胞功能的影响.结果 在联合免疫早期,鼠疫杆菌及牛布鲁氏杆菌同时免疫情况下巨噬细胞M1方向的极化减弱(包括细胞表面CD16/32表达降低及Detectin-1表达升高,细胞内IL-12表达降低及IL-4表达升高),提示疫苗间的相互干扰.同时,两菌联合接种组CD8+T细胞的活性(包括CD8+CD69+T、CD8+INF-γ+T以及CD8+Granzyme B+T细胞的比例)也减弱,出现与巨噬细胞表型一致的变化趋势.结论 联合免疫早期巨噬细胞表型与后期反映抗感染免疫应答能力的CD8+T细胞表型及功能出现一致性变化,提示巨噬细胞表型变化有可能应用于早期快速评价联合免疫的效果.
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回阳生肌方不同拆方对巨噬细胞表型转化的调节作用
目的 观察回阳生肌方的拆方(益气温阳方、活血通络方)对巨噬细胞表型转化的影响.方法 人单核细胞株(THP-1)细胞用佛波醇酯类多克隆刺激剂(PMA)刺激成巨噬细胞后,加入脂多糖(LPS)、γ-干扰素(INF-γ)刺激48 h,转化为M1型巨噬细胞.洛伐他汀(40.50 mg/L)作为阳性对照药物;采用CCK-8方法观察益气温阳方、活血通络方对巨噬细胞活性的影响;以中性红法检测其对巨噬细胞吞噬功能的影响.M1型巨噬细胞加入洛伐他汀、益气温阳方、活血通络方24 h后, PCR法检测诱导型一氧化氮合酶(iNOS)mRNA、精氨酸酶1(Arg-1)mRNA的表达;CBA法检测上清液中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-12(IL-12)、白细胞介素-10(IL-10)和生长因子(VEGF)的含量;ELISA法检测上清液中转化生长因子β(TGF-β)的含量.结果 益气温阳方在浓度4、0.8、0.16 mg/L时、活血通络方在浓度32、6.4、1.28 mg/L时对巨噬细胞增殖无影响,但可促进巨噬细胞对中性红的吞噬,分别作为益气温阳方、活血通络方的高、中、低浓度.加入LPS、INF-γ后,M1型巨噬细胞标志物iNOS mRNA显著升高,而加入洛伐他汀、益气温阳方及活血通络方后显著降低(P<0.01);M2型巨噬细胞标志物Arg-1 mRNA表达相对于正常组显著降低,而洛伐他汀、益气温阳方和活血通络方都明显促进Arg-1 mRNA表达(P < 0.01),但益气温阳方、活血通络方与洛伐他汀相比,Arg-1 mRNA表达显著降低.以上药物作用M1型巨噬细胞细胞24 h后,TNF-α、IL-6、IL-1含量显著降低,VEGF、TGF-β含量显著升高,益气温阳方高浓度使IL-10含量显著升高(P<0.05).与洛伐他汀相比,活血通络方和益气温阳方高浓度组VEGF、TGF-β差异有统计学意义(P< 0.05).结论 益气温阳方和活血通络方均在一定程度上抑制M1型巨噬细胞标志物iNOS mRNA表达和诱导M2型巨噬细胞标志物Arg-1 mRNA的表达,并且可抑制M1型巨噬细胞因子的分泌,促进M2型巨噬细胞因子的分泌.
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脂多糖通过Galectin-9/Tim-3信号通路调控小鼠巨噬细胞M1/M2表型极化
目的 探讨半乳糖凝集素-9/T细胞免疫球蛋白黏蛋白-3(Galectin-9/Tim-3)信号通路在脂多糖(LPS)诱导小鼠巨噬细胞M1/M2表型极化中的意义及分子机制.方法 体外培养小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7,待细胞生长至80％～90％时用于实验.① 将细胞以无血清DMEM培养基培养,并分别以0(空白对照)、0.01、0.1、1、10、100 mg/L的LPS刺激24 h.采用荧光定量反转录-聚合酶链反应(RT-qPCR)或蛋白质免疫印迹试验(Western Blot)检测巨噬细胞M1型标志物白细胞介素-6(IL-6)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和M2型标志物精氨酸酶-1(Arg-1)、白细胞分化抗原206(CD206)以及细胞内Tim-3、Galectin-9的表达.② 另取小鼠腹腔巨噬细胞,并分为空白对照组(用无血清DMEM培养基培养24 h)、LPS处理组(用含0.1 mg/L的LPS无血清DMEM刺激24 h)和α-乳糖预处理组(在LPS刺激前1 h用含40μmol/L Galectin-9信号拮抗剂α-乳糖的无血清DMEM进行预处理),通过封闭Galectin-9信号以验证Galectin-9在巨噬细胞M1/M2表型极化中的作用.结果 ① 低浓度LPS(0.01 mg/L、0.1 mg/L)刺激24 h后,巨噬细胞M1型标志物的表达仅轻度上调(iNOS mRNA)或无明显变化(IL-6 mRNA);而M2型标志物Arg-1 mRNA和CD206 mRNA表达则明显升高,并分别于0.1 mg/L和0.01 mg/L的LPS浓度下达到峰值〔与空白对照组比较:Arg-1 mRNA(2-ΔΔCt)为1.85±0.07比1.00±0.02,CD206 mRNA(2-ΔΔCt)为2.03±0.11比1.00±0.05,均P<0.01〕;随LPS浓度升高,IL-6 mRNA和iNOS mRNA表达持续升高,而Arg-1 mRNA和CD206 mRNA表达则逐渐降低,巨噬细胞M1/M2表型极化状态发生改变.同时,经LPS刺激后,巨噬细胞内Tim-3蛋白表达在0.01 mg/L的LPS刺激后即较空白对照组明显上调(Tim-3/GAPDH:0.84±0.04比0.69±0.02,P<0.01),并在0.1 mg/L浓度下达峰值,之后随LPS浓度升高而逐渐下降;细胞内Galectin-9及上清中分泌型Galectin-9(s-Galectin-9)蛋白表达在低浓度LPS(0.01 mg/L、0.1 mg/L)刺激后无明显变化,之后随LPS浓度升高而逐渐降低.② 与空白对照组相比,LPS处理组M1型标志物iNOS和M2型标志物Arg-1、CD206的mRNA表达均明显升高,而IL-6 mRNA表达无明显变化.使用α-乳糖预处理后,IL-6 mRNA和iNOS mRNA表达较LPS处理组进一步升高〔IL-6 mRNA(2-ΔΔCt):1.44±0.02比1.14±0.11,iNOS mRNA(2-ΔΔCt):2.45±0.04比2.01±0.08,均P<0.01〕,而Arg-1 mRNA和CD206 mRNA表达明显下降〔Arg-1 mRNA(2-ΔΔCt):0.75±0.01比1.85±0.02,CD206 mRNA(2-ΔΔCt):0.58±0.02比2.03±0.14,均P<0.01〕.同时,Galectin-9信号封闭也可减少Galectin-9胞外分泌〔与LPS处理组比较:s-Galectin-9/GAPDH为0.10±0.01比0.23±0.02,P<0.01〕,下调胞内Tim-3和Galectin-9的蛋白表达(Tim-3/GAPDH:0.28±0.01比0.43±0.01,Galectin-9/GAPDH:0.21±0.01比0.43±0.01,均P<0.01).结论 LPS通过Galectin-9/Tim-3信号通路调控巨噬细胞M1/M2表型极化,低浓度LPS可通过调节Galectin-9表达及分泌使巨噬细胞向M2表型极化,从而限制炎症发展;高浓度LPS通过下调Galectin-9的表达和分泌使巨噬细胞向M1表型极化,从而促进炎症发展.
关键词： 半乳糖凝集素-9 T细胞免疫球蛋白黏蛋白-3 脂多糖 巨噬细胞表型 极化 -
胰岛素对高糖环境中巨噬细胞表型转换的影响
目的· 研究胰岛素对高糖培养的人单核细胞株THP-1细胞及糖尿病创面巨噬细胞表型转换的影响.方法· 分别用正常糖(5.6 mmol/L)和高糖(25 mmol/L)培养THP-1细胞,PMA刺激贴壁后,LPS诱导分化为M1型巨噬细胞,胰岛素处理细胞6 h.使用RT-PCR、Western blotting检测M1型标记物诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)以及M2型标记物精氨酸酶1(Arg1)、IL-10表达的变化.高脂饮食喂养联合小剂量链脲佐菌素(STZ)多次腹腔注射诱导2型糖尿病大鼠模型;血糖稳定5周后,在糖尿病大鼠背部制作2个直径1 cm的全层皮肤缺损创面,应用随机数字表法将创面随机分为胰岛素处理创面和生理盐水处理创面,分别滴加0.2 U胰岛素/20μL生理盐水或20μL生理盐水.于伤后第3、7、25日,观察创面巨噬细胞表型特征;以正常大鼠(n=3)作为正常对照.结果·经高糖培养后,由THP-1细胞诱导分化的巨噬细胞M1型标记物iNOS、TNF-αmRNA表达上调,而M2型标记物Arg1、IL-10 mRNA表达下调;胰岛素作用6 h后,iNOS、TNF-αmRNA表达下调,iNOS、IL-1β蛋白表达也下调,而Arg1、IL-10 mRNA及蛋白表达均上调.此外,高糖培养的巨噬细胞磷酸化NF-κB-p65水平明显升高,而胰岛素干预后磷酸化NF-κB-p65水平显著降低.与正常对照大鼠皮肤创面相比,糖尿病大鼠创面巨噬细胞iNOS表达明显升高;伤后第3、7日,生理盐水处理创面巨噬细胞iNOS高表达;伤后第25日,Arg1表达较低.伤后第7日起,胰岛素处理创面巨噬细胞iNOS表达开始下调;伤后第25日,Arg1的表达显著高于生理盐水处理创面.结论·胰岛素可诱导高糖环境中的巨噬细胞由M1表型向M2表型转换,其机制可能与NF-κB-p65的磷酸化有关.
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SHP-2对Apo E基因敲除小鼠动脉粥样硬化斑块及其内部巨噬细胞表型的影响
目的 观察磷酸酶SHP-2对Apo E基因敲除(Apo E-/-)小鼠动脉粥样硬化斑块及其内部巨噬细胞(Mφ)表型的影响.方法 将Apo E-/-小鼠(动脉粥样硬化模型小鼠)随机分为实验组和模型组各16只,均给予高脂饲料喂养,同时实验组腹腔注射溶于0.5％DMSO的SHP-2抑制剂PHPS13 mg/(kg·d),模型组腹腔注射等量0.5％DMSO,每天注射1次,共16周.用油红O和Movat染色分别评估主动脉整体和主动脉根部斑块面积,天狼星红、免疫组化染色分别检测主动脉根部斑块内胶原、Mφ(galectin-3/MAC-2阳性区域)和平滑肌细胞(β-actin阳性区域),应用实时荧光定量PCR法检测降主动脉中的M1型(iNOS、TNF-α 和IL-6)和M2型(IL-10、Arg-1和FIZZ-1)Mφ标志性因子基因.结果 实验组主动脉整体和主动脉根部斑块面积小于模型组,但差异无统计学意义.与模型组比较,实验组主动脉根部斑块内Mφ阳性区域减小(P<0.05),平滑肌细胞、胶原成分阳性区域增大(P均<0.05);降主动脉斑块内M1型Mφ标志性因子基因表达降低(P均<0.05),M2型Mφ标志性因子基因表达升高(P均<0.05).结论 磷酸酶SHP-2可抑制Apo E-/-小鼠动脉粥样硬化斑块内Mφ向M2型分化,从而导致斑块不稳定性增加.
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巨噬细胞表型改变在先天性巨结肠相关性小肠结肠炎中的研究
目的 通过检测先天性巨结肠患儿结肠组织中巨噬细胞表型的改变,探讨巨噬细胞活化与巨结肠相关性肠炎发病之间的关系.方法 收集先天性巨结肠患儿(肠炎组4例,非肠炎组6例)结肠远段及近段标本,行HE染色、评估各段肠管炎症损伤程度,CD68和iNOS免疫荧光双染法评估M1型巨噬细胞活化状况,CD68和Arg-1免疫荧光双染法评估M2型巨噬细胞活化状况,RT-qPCR检测各组肠管iNOS及Arg-1的mRNA表达水平.结果 免疫荧光染色显示,肠炎组近段结肠iNOS/CD68阳性细胞的百分比(73.12±2.48)％明显高于肠炎组远段结肠(54.19±1.98)％、非肠炎组近段结肠(49.35±2.70)％及远段结肠(43.18±4.21)％;而肠炎组近段结肠Arg-1/CD68阳性细胞的百分比(33.15±4.81)％明显低于远段结肠(49.32±3.98)％;非肠炎组近段结肠Arg-1/CD68阳性细胞的百分比(45.23±1.95)％亦低于远段结肠(56.52±2.79)％,差异有统计学意义(P＜0.05).RT-qPCR结果显示,肠炎组近段结肠iNOS表达明显升高,而Arg-1表达则在肠炎组及非肠炎组的远段结肠升高(P＜0.05).结论 先天性巨结肠相关性小肠结肠炎的发生可能与巨噬细胞向M1型转化有关.
关键词： 先天性巨结肠相关性小肠结肠炎 巨噬细胞表型 -
牙周炎对小鼠脾脏巨噬细胞表型的影响
目的：研究实验性牙周炎模型小鼠的脾脏巨噬细胞表型、分泌功能及相对数量变化，以探究牙周炎对脾脏巨噬细胞的影响。方法：22只22周龄小鼠随机分为真性结扎组（ P10d 组）和假性结扎对照组（ C 组），各11只牙周结扎10 d后处死。流式细胞术检测单核巨噬细胞及其M1、M2表型的比例。实时荧光定量PCR法检测脾脏中巨噬细胞相关抗炎型细胞因子IL-1β，抑炎型细胞因子IL-10促炎型 mRNA相对表达水平的差异。结果：与C组相比，牙周炎组的M1型巨噬细胞占脾成熟巨噬细胞比例下降，M1／M2比例显著下降，M1型巨噬细胞炎症因子IL-1β mRNA表达水平下降。结论：慢性牙周炎能下调M1型巨噬细胞比例，使巨噬细胞表型M1／M2比例下降，促炎因子IL-1β mRNA表达水平下降。
