首页 > 文献资料
-
通幽汤对食管鳞癌细胞MMP-2、MMP-9及TIMP-1表达的影响
目的:探讨通幽汤对食管鳞癌细胞基质金属蛋白酶2、9(MMP-2、MMP-9)及基质金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP-1)的影响.方法:体外培养食管鳞癌KYSE150细胞,通幽汤全方作用于细胞,CCK-8实验检测细胞增殖变化,细胞划痕实验观察细胞迁移情况,Transwell法观察细胞侵袭情况,荧光显微镜观察细胞凋亡情况,ELISA法测定食管鳞癌细胞培养上清液中MMP-2、MMP-9、TIMP-1含量,Western-blot法检测细胞MMP-2、MMP-9、N-钙黏联蛋白(N-cadherin)、TIMP-1、E-钙黏联蛋白(E-cadherin)表达量变化.结果:与对照组比较,研究组食管鳞癌细胞迁移速率和侵袭能力下降,MMP-2、MMP-9、N-cadherin蛋白水平降低,TIMP-1、Ecadherin蛋白水平升高.结论:通幽汤可能通过调控食管鳞癌细胞侵袭和转移中的关键分子MMP-2、MMP-9、TIMP-1及钙黏联蛋白的表达,抑制癌细胞的侵袭和转移.
-
ATF5蛋白对食管鳞癌细胞耐药性影响
目的 食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)多药耐药严重影响化疗效果,其分子机制仍未阐明.本研究通过构建不同ATF5蛋白表达量的食管癌Eca-109细胞模型,探究过表达ATF5及低表达ATF5对食管癌Eca-109细胞耐药性及凋亡的影响.方法 利用脂质体载体转染技术对食管癌细胞株进行转染,建立高、中(转染空质粒的对照组)、低3组不同ATF5蛋白表达量Eca-109细胞模型.蛋白质印迹法检测3组细胞ATF5蛋白表达水平.MTT实验和平板克隆实验观察3组细胞对紫杉醇、顺铂耐受性的变化;DAPI染料核染色后观察3组细胞在紫杉醇、顺铂作用下凋亡反应的差异;分析ATF5蛋白对食管鳞癌Eca-109细胞耐药的影响.结果 利用转染技术成功构建的3组不同ATF5蛋白表达量的Eca-109细胞模型,表达模型组细胞中ATF5蛋白相对表达量为85.9±2.66,对照组为64.35±2.54,低表达模型组为45.3±3.11,3组差异有统计学意义,F=532.323,P＜0.001.MTT实验显示,紫杉醇、顺铂作用72 h后,3组细胞存活率差异有统计学意义,F紫=163.382,P＜0.001;F顺 =579.36,P＜0.001;同一组细胞不同浓度对存活率的影响差异有统计学意义,F紫=616.32,P＜0.001;F顺 =2 558.05,P＜0.001;不同浓度的紫杉醇、顺铂作用3组细胞后,过表达组细胞的半数抑制率浓度(IC50)分别为4.16±2.21和1.54±0.67;对照组分别为1.54±0.92和1.27±0.65;低表达组细胞的半数抑制率浓度分别为0.33±0.21和0.53±0.62,3组差异有统计学意义,F紫=198 330.768,P＜0.001;F顺=64 298.048,P＜0.001;表明过表达ATF5的细胞对紫杉醇、顺铂的药物耐受性均明显升高而低表达模型组细胞对紫杉醇、顺铂的药物耐受性均明显降低.DAPI染色实验显示,紫杉醇、顺铂作用3组细胞后,过表达组细胞的凋亡率分别为(14.04±1.66)％和(11.75±2.09)％;对照组分别为(26.44±2.99)％和(34.07±3.42)％;低表达组细胞的凋亡率分别为(54.85±5.88)％和(66.66±2.81)％,3组差异有统计学意义,F紫=283.976,P＜0.001;F顺=954.464,P＜0.001.提示过表达ATF5蛋白细胞在紫杉醇、顺铂作用下凋亡细胞均减少,低表达ATF5细胞在紫杉醇、顺铂作用下凋亡细胞均增加.平板克隆形成实验显示,紫杉醇、顺铂作用3组细胞后,过表达组细胞的克隆形成率分别为(56.09±1.37)％和(62.67±1.41)％;对照组分别为(38.7±1.37)％和(34.83±3.09)％;低表达组细胞的克隆形成率分别为(25.22土1.58)％和(18.17±3.64)％,3组差异有统计学意义,F紫 =1157.447,P＜0.001;F顺=612.595,P＜0.001.表明过表达ATF5蛋白细胞在紫杉醇、顺铂作用下克隆形成数均更多,低表达ATF5蛋白细胞在紫杉醇、顺铂作用下克隆形成数减少.结论 上调ATF5蛋白的表达能增加食管鳞癌Eca-109细胞对紫杉醇、顺铂的耐药性,而下调ATE5蛋白的表达则能降低Eca-109细胞对紫杉醇、顺铂的耐药性,提示食管鳞癌细胞的耐药性可能与ATF5蛋白的表达量相关,食管鳞癌细胞中ATF5蛋白的表达情况可能能间接干扰临床药物化疗的效果.
-
沉默PHF8重组慢病毒的制备及其对食管鳞癌细胞增生的影响
目的 制备锌指蛋白8(plant homeodomain finger protein 8,PHF8)RNA干扰(RNA interference,RNAi)重组慢病毒(lentivirus)颗粒,建立PHF8表达沉默的人食管鳞癌(esophageal squamous-cell carcinoma,ESCC)稳定细胞系并观察PHF8对细胞增生的影响.方法将目的 基因或阴性对照短发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)载体与包装载体共转染病毒包装细胞293T,收集并浓缩上清液获得重组慢病毒;测定病毒滴度后用于感染食管鳞癌细胞;通过荧光显微镜及流式细胞仪观察感染效率,嘌呤霉素筛选法建立稳定细胞系;定量PCR及Western Blotting检测PHF8的表达沉默;MTS法检测细胞的增生特性.结果成功制备了沉默PHF8的重组慢病毒;应用重组病毒感染食管鳞癌细胞后,PHF8 mRNA 和蛋白的表达水平显著降低,细胞的增生明显下降.结论慢病毒介导的shRNA干扰能有效抑制食管鳞癌细胞的PHF8表达及细胞增生.
-
在Eca109细胞中Lrig1对Survivin和Caspase-9的调控研究
目的 采用多亮氨酸重复区免疫球蛋白样蛋白1 (Lrig1)过表达的方式,确定在食管鳞癌细胞(Eca109细胞)中是否存在Lrig1对Survivin和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase-9)的调控.方法 使用重组质粒GV-219-Lrig1转染Eca109细胞使其过表达Lrig1;采用荧光定量聚合酶链式反应(PCR)法和蛋白质印迹法分别检测细胞中Lfig1、Survivin和Caspase-9的信使核糖核酸(mRNA)及蛋白的表达水平,使用流式细胞仪检测细胞凋亡情况.结果 重组质粒GV-219-Lrig1转染Eca109细胞24 h后,在mRNA水平,Lrig1表达量显著增高(P＜0.01),而Survivin和Caspase-9无明显变化(P＞0.05);在蛋白水平,Lrig1和Cleaved-Caspase-9表达量都显著增加(P＜0.05),而Survivin表达量无明显变化(P＞0.05);流式细胞仪检测结果显示,与GV-219(NC组)相比,重组质粒GV-219-Lrig1转染的Eca109细胞24 h细胞晚期凋亡率增加1.6％.结论 在Eca109细胞中,过表达Lrig1使其在转录和蛋白水平的表达量显著增加,可明显增加Cleaved-Caspase-9的蛋白水平.但对Survivin的表达没有影响.其调控机制尚待进一步研究.
-
Toll样受体9在食管鳞癌细胞的表达及作用
目的 观察Toll样受体9(TLR9)在食管鳞癌细胞的表达及作用.方法 用RT-PCR方法检测食管鳞癌细胞系TE10、TE30和TE70上TLR9的表达；流式细胞术检测TE10细胞上TLR9的表达；用TLR9的激动剂CpG寡脱氧核苷酸(CpG ODN) 10μg/ml分别作用TE10细胞12 h、24 h和48 h后,用MTT法检测细胞生长抑制率.结果 TE10细胞上有TLR9的表达；TLR 9激动剂CpG ODN作用于TE10细胞后不同时间均能明显促进TE10细胞生长(P＜0.01).结论 TLR9激动剂CpG ODN可促进食管鳞癌细胞的增殖,提示TLR9可能是食管鳞癌治疗的靶点之一.
-
体外研究腺苷酸活化蛋白激酶对食管鳞癌EC9706细胞增殖及凋亡的影响
目的 通过体外研究观察腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)的激活剂AICAR对人食管癌EC9706细胞的增殖及凋亡影响.方法 AICAR以不同浓度作用于人食管癌EC9706细胞,通过光学显微镜观察不同时间后EC9706细胞的生长状态,并用MTT方法检测其吸光度值及细胞存活率的变化,流式细胞术检测其细胞凋亡率情况.结果 随着AICAR浓度的增加,细胞的死亡数目明显增加.MTT法检测结果表明,AICAR能够抑制EC9706细胞增殖,并呈现出良好的浓度依赖性.流式细胞术检测结果显示,不同浓度的AICAR干预24 h后早期凋亡率、晚期凋亡率及总凋亡率均高于对照组,但仅有总凋亡率有统计学意义(P＜0.01).结论 AMPK可以抑制人食管癌EC9706细胞的生长增殖,并可诱导EC9706细胞凋亡.
-
神经生长因子受体阳性的人食管鳞癌细胞的分选及其干细胞特性
目的 应用免疫磁珠分选(magnetic activated cell sorting，MACS)法分选人食管鳞癌细胞(esophageal squamous carcinoma cell，ESCC)中的神经生长因子受体(nerve growth factor receptor，NGFR)阳性细胞，并对其肿瘤干细胞样特征进行研究。方法 采用MACS分选人ESCC中的NGFR阳性细胞。通过流式细胞仪法测定分选细胞的纯度及细胞周期分布，并计算细胞回收率；MTT法测定细胞数，绘制生长曲线并计算细胞群体倍增时间；平板克隆实验测定平板克隆形成率；裸鼠接种成瘤实验测定体内致瘤性,从而鉴定NGFR阳性ESCC的干细胞特性。结果 NGFR阳性细胞约占肿瘤细胞的1.89％,经过磁珠分选后纯度显著提高,达89.94％，细胞回收率为19.83％。与未分选细胞相比,分选后NGFR阳性细胞的增殖速度明显提高,生长曲线左移，细胞倍增时间缩短[(25.22±8.15)h vs.(47.41±12.69)h，P=0.01]，平板克隆形成率显著增加[(16.27±8.31)％ vs.(1.22±0.35)％，P=0.00]，处于活跃增殖期S、G2、M期的细胞显著增加(72.7％ vs .18.8％)；裸鼠皮下接种的转移瘤形成率增加(8/10 vs.1/10)，转移瘤重量显著增加[(0.72±0.53)gvs.(0.16±0.26)g，P=0.00]。结论 应用MACS技术能有效分选出人ESCC中的NGFR阳性细胞，其具有肿瘤干细胞特性。
-
食管鳞癌细胞培养上清液对正常CD3+CD56+NKT细胞亚型、表面受体及效应分子表达的影响
目的 观察食管鳞癌细胞株培养上清液对健康人外周血CD3+CD56+NKT细胞亚型、表面受体及效应分子表达的影响.方法 取30例健康志愿者的外周血,用淋巴细胞分离液常规方法分离外周血单核细胞.收集食管鳞癌细胞株Eca9706、Kyse150的培养上清液,将上清液与含10％胎牛血清的RPMI1640培养基按1:1混合以配制条件培养基.将外周血单核细胞分为对照组、Eca9706组、Kyse150组.对照组细胞仅用含IL-2、10％胎牛血清的RPMI1640培养液培养;Eca9706组、Kyse150组细胞加入IL-2刺激24 h后,分别更换条件培养基(Eca9706细胞培养上清液、Kyse150细胞培养上清液)培养48 h.收集各组细胞,选择流式细胞仪的CD3+CD56+的细胞群设计分析,分析各组CD3+CD56+NKT细胞亚型,检测CD3+CD56+NKT细胞中的表面受体(NKG2D、NKG2A、NKP30、NKP44、CD158b、CD271)及效应分子(穿孔素、颗粒酶、Ki-67).结果 Eca9706组及Kyse150组的CD3+CD56+NKT细胞中CD4+CD8-NKT细胞比例高于对照组,CD4-CD8-NKT细胞比例低于对照组(P均<0.05).Eca9706组、Kyse150组的CD3+CD56+NKT细胞中NKG2A、CD158b表达率高于对照组,NKP44、NKP30、CD271表达率低于对照组(P均<0.05).Eca9706组的CD3+CD56+NKT细胞中穿孔素表达率低于对照组(P<0.05);Eca9706组的CD3+CD56+NKT细胞中Ki-67表达率高于对照组(P<0.05).结论 食管鳞癌细胞株培养上清液能改变正常CD3+CD56+NKT细胞的亚型,使细胞表面活化型受体和抑制型受体表达比例失衡,并下调效应分子穿孔素的表达,使CD3+CD56+NKT细胞的免疫监视功能受损.上述变化可能是食管鳞癌细胞逃避机体免疫监视的机制之一.
-
蛋白酶体激活因子 PA28α对 Eca109和 EC9706细胞细胞周期和凋亡的影响
目的：探讨蛋白酶体激活因子PA28α对食管鳞癌细胞周期和凋亡的影响。方法：扩增PA28α的cDNA全长序列并连接到pCMV-Myc上，构建真核表达载体pCMV-Myc-PA28α，脂质体法转染食管鳞癌细胞系Eca109和EC9706，荧光显微镜观察PA28α蛋白在细胞中的定位；Western blot 法鉴定重组载体的表达；流式细胞仪检测PA28α在食管鳞癌EC9706细胞中过表达对其细胞周期和凋亡的影响。结果：转染了重组载体pCMV-Myc-PA28α的食管鳞癌Eca109和EC9706细胞中PA28α蛋白主要存在于细胞质。与空载体转染组（0．342±0．007）相比，pC-MV-Myc-PA28α转染组（1．073±0．040）EC9706细胞中有较高的PA28α蛋白表达（F＝984．411，P＜0．001）。与空载体转染组（37．642±1．000）相比，pCMV-Myc-PA28α转染组（39．258±0．154）EC9706细胞处于S期细胞比例明显增高（F＝24．592，P＜0．001）。 pCMV-Myc-PA28α转染组EC9706细胞的凋亡率（14．463％±0．634％）明显低于空载体转染组（43．893％±0．473％），差异有统计学意义（F＝1448．569，P＜0．001）。结论：PA28α与食管鳞癌的凋亡有密切关系，可能成为治疗食管鳞癌的一个有效靶点。
-
雷公藤内酯醇联合顺铂对食管鳞癌细胞ECA-109增殖的影响
目的 观察雷公藤内酯醇(TPL)以及TPL联合顺铂对人食管鳞癌细胞ECA-109增殖的影响,并探讨其作用机制.方法 选取对数生长期的人ECA-109细胞,随机分为空白对照组(不经药物处理)、不同浓度(6.25、12.50、25.00、50.00、100.00 μg·L-1)TPL组、4.17 μmol·L-1顺铂组、TPL(25.00 μg·L-1)联合顺铂(4.17 μmol·L-1)组;采用四甲基偶氮唑蓝法测定各组不同时间段(24、48、72 h)的细胞增殖抑制率,并计算TPL与顺铂之间的交互作用;采用Western blot检测空白对照组、25.00 μg·L-1 TPL处理组、4.17 μmol·L-1顺铂组、TPL联合顺铂组细胞培养24 h后半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-3(caspase-3)的表达.结果 同一时间点,不同浓度TPL组对ECA-109细胞增殖的抑制率显著高于空白对照组(P＜0.05),且呈剂量依赖性(P＜0.05);同一药物浓度条件下,随作用时间延长,细胞增殖抑制率显著增加(P＜0.05),即呈时间依赖性.同一时间点,TPL联合顺铂组对ECA-109的抑制率高于同药物浓度条件下单用顺铂或单用TPL对细胞增殖的抑制率(P＜0.05).加药培养24h后,TPL组、顺铂组及TPL联合顺铂组caspase-3蛋白表达量均显著高于空白对照组(P＜0.05),且TPL联合顺铂组caspase-3蛋白表达量高于同药物浓度条件下单用TPL组、单用顺铂组蛋白表达量(P＜0.05).结论 TPL具有抑制食管癌ECA-109细胞增殖的作用,TPL联合顺铂有协同作用,增加对食管癌ECA-109细胞的抑制,其机制可能与促进caspase-3蛋白表达有关.
关键词： 雷公藤内酯醇 顺铂 食管鳞癌细胞 半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-3 -
食管癌细胞线粒体中MYH9蛋白的分布及与SLP-2结合的研究
目的 研究非肌性肌球蛋白重链9(myosin,heavy chain 9,non-muscle,MYH9)蛋白在食管鳞癌细胞线粒体内的分布,及MYH9蛋白与线粒体相关蛋白SLP-2的结合情况.方法 使用抗stomatinlike protein 2(SLP-2)抗体,在食管鳞癌细胞系KYSE 150细胞的裂解液里进行免疫共沉淀,共沉淀物使用MALDI-TOF-MS蛋白质质谱进行分析,以分析与线粒体相关蛋白SLP-2结合的分子.对分析结果再继续使用免疫共沉淀及GST pull down法进行验证.使用蔗糖密度梯度离心纯化分离细胞线粒体,利用Western blot明确MYH9在食管癌细胞线粒体内的分布.结果 在食管鳞癌细胞系KYSE150细胞的裂解液内,MYH9蛋白可与SLP-2蛋白共沉淀,并且MYH9蛋白也能与GST-SLP-2结合.MYH9蛋白既存在于KYSE 150细胞分离纯化后的细胞质中,也存在于分离出的线粒体中.结论 MYH9在食管癌细胞内部分分布于线粒体中,并与线粒体相关蛋白SLP-2相互结合.MYH9可能影响食管癌细胞线粒体的功能.
关键词： 非肌性肌球蛋白重链9 SLP-2 线粒体 食管鳞癌细胞 -
白桦脂酸上调DHX15表达抑制食管鳞癌细胞增殖和迁移的研究
目的:探究白桦脂酸对食管鳞癌细胞Eca109的增殖、迁移的影响及其可能的作用机制.方法:在含有0,20,40,80μg·ml-1白桦脂酸培养液中培养Eca109细胞.体外转染siRNA-DHX15至Eca109细胞后在白桦脂酸培养液培养,细胞分为NC-siRNA组、DHX15 siRNA组、NC-siRNA+白桦脂酸组、DHX15 siRNA+白桦脂酸组,CCK-8法检测细胞增殖,平板细胞克隆形成实验检测菌落形成,免疫印迹(WB)法检测(天冬-谷-丙-组氨酸)盒多肽(DHX15)、vimentin、MMP-2、MMP-9蛋白表达;Tr-answell小室系统检测细胞迁移、侵袭能力.结果:随着白桦脂酸剂量的增加,细胞抑制率逐渐升高(P<0.05),当白桦脂酸为80μg·ml-1时,细胞抑制率高.与空白组相比,白桦脂酸各组DHX15蛋白表达均升高;随着处理剂量的增加,蛋白表达逐渐升高(P<0.05).与空白组、NC-siRNA组相比,DHX15 siRNA组DHX15表达降低,菌落数数量、侵袭、迁移数量增多,NC-siRNA+白桦脂酸组DHX15表达升高,菌落数数量、侵袭、迁移数量减少(P<0.05).与DHX15 siRNA+白桦脂酸组相比,DHX15 siRNA组DHX15表达降低、菌落数数量、侵袭、迁移数量增多,NC-siRNA+白桦脂酸组DHX15表达升高,菌落数数量、侵袭、迁移数量增多(P<0.05).结论:白桦脂酸可通过上调DHX15抑制食管鳞癌细胞Eca109的增殖、迁移,其机制可能与抑制迁移有关蛋白表达有关.
-
通幽汤含药血清对食管鳞癌细胞TGF-β1/Smad信号通路的影响
目的:探讨通幽汤含药血清对食管鳞癌细胞TGF-α1/Smad信号通路的影响.方法:将28例食管鳞癌患者随机分为对照组和治疗组,每组14例,空白组于治疗前制备血清.对照组予化疗,治疗组在化疗基础上予口服通幽汤汤剂,治疗2个月制备含药血清.将各组血清加入食管鳞癌细胞培养体系中,qRT-PCR的方法检测TGF-β1 R Ⅰ、TGF-β1 RⅡ、p-Smad2/3、Smad4及Smad7 mRNA在食管癌细胞系中的表达;Western-blot检测以上蛋白在不同处理组细胞中的表达;ELISA法测定培养上清液中MMP-2、MMP-9及TIMP-1的含量.结果:与对照组比较,治疗组TGF-β1 R Ⅰ、TGF-β1 RⅡ、p-Smad2/3、Smad4表达明显降低,Smad7蛋白水平明显升高;MMP-2、MMP-9明显下降,而TIMP-1水平明显升高.结论:通幽汤含药血清可能通过调控食管鳞癌细胞TGF-β1/Smad信号通路中关键分子的表达,抑制TGF-β1/Smad信号通路传导,进一步减少MMP-2、MMPO的表达,增加TIMP-1的表达,抑制肿瘤细胞的侵袭和转移.
关键词： 通幽汤 含药血清 食管鳞癌细胞 TGF-β1/Smad信号通路
