LIMK1-siRNA真核载体的构建及在人软骨细胞中的蛋白表达

目的 构建LIMK1-siRNA真核表达载体,为骨关节发病机制的研究奠定基础.方法 合成3条LIMK1的小RNA分子的寡聚脱氧核苷酸链,重组质粒测序,瞬时转染人软骨细胞,采用Western blot检测LIMK1表达情况.结果 Western blot检测LY3号质粒的细胞中LIMK1蛋白表达明显下调,经通用引物对LY3号重组质粒测序鉴定,与设计序列核对完全相符.结论 成功构建LIMK1-siRNA真核表达载体,有效沉默了人软骨细胞中LIMK1蛋白表达.

Aneuploid embryo generally leads to infertility, spontaneous abortion and birth defects, mainly resulting from abnormal chromosome segregation during maternal oocytes meiosis. Chromosome division is conducted by bipolar spindle which formed through an acentrosomal way, dependent on a unique microtubule organizing center ( MTOC) in mammalian oocytes, however, the molecular composition and functional regulation of MTOC is still not fully ex-plored. LIM kinases 1 (LIMK1) is a conserved serine/threonine kinase, a major regulator of actin and microtubule dynamics, involved in microtubule stability and spindle positioning during mitosis. So far little is known about LIMK1 protein expression and its roles in oocytes during meiosis. We reported here the protein expression and sub-cellular distribution of LIMK1 in mouse oocytes during meiosis. Western blot procedure detected high and stable expression of LIMK1 in mouse oocytes from germinal vesicle ( GV) stage to metaphase II ( MII) . In contrast, acti-vated LIMK1 ( phosphorylated at Thr508 , pLIMK1 Thr508 ) was only observed after germinal vesicle breakdown ( GVBD) , and gradually increased with peak levels at metaphase I ( MI) and MII. Immunofluorescence analysis showed that LIMK1 was co-localized with microtubules on the whole spindle structure, while pLIMK1Thr508 was con-
centrated with key components of MTOC,pericentrin and -Tubulin, on spindle poles in mouse oocytes. Inhibition of LIMK1 activity by BMS3, a specific ATPase competitive inhibitor, distroyed the formation of bipolar spindle structure, disturbed MTOC integrity and MTOC proteins recruitment to spindle poles. Moreover, LIMK1 inhibition caused chromosome misalignment and meiotic progression arrest at MI stage. Therefore, LIMK1 activity is required for formation and maintenance of bipolar spindle in mouse oocytes,importantly, pLIMK1T508 is MTOC-associated protein,involved in establishment and positioning of MTOC.

罗格列酮对人胃癌细胞系迁移侵袭的抑制及其机制

目的:探讨罗格列酮对人胃癌SGC7901、SGC7901/VCR细胞侵袭转移能力及LIMK1基因蛋白表达的影响.方法:罗格列酮(40 mg/L)作用SGC7901和SGC7901/VCR细胞24 h后,采用划痕实验和Transwell实验分别观察罗格列酮对细胞的迁移和侵袭能力.RT-PCR检测LIMKl mRNA和cofilin-1 mRNA的表达情况；Western blot检测LIMK1和p-cofilin-1的蛋白表达,结果:结果显示,40 mg/L罗格列酮分别作用SGC7901细胞和SGC7901/VCR细胞24 h后,细胞的迁移和侵袭能力均被罗格列酮抑制(P＜0.05).RT-PCR结果显示LIMKl mRNA水平明显下降（P＜0.05）,cofilin-1无明显影响(P＞0.05).Western blot检测显示罗格列酮作用SGC7901细胞和SGC7901/VCR细胞24 h后,LIMK1和p-cofilin-1蛋白的表达水平下降(P＜0.05).结论:罗格列酮可抑制人胃癌SGC7901和SGC7901/VCR细胞迁移与侵袭能力；罗格列酮抗肿瘤细胞迁移与侵袭的机制可能与其下调LIMK1进而抑制cofilin-1的激活相关.

靶向LIMK1的siRNA 真核表达载体(pSUPER-LIMK1)的构建、鉴定及在人成骨肉瘤MG63细胞中的表达

目的 构建靶向人LIMK1的siRNA 真核表达载体(pSUPER-LIMK1)并检测其在人成骨肉瘤MG63细胞中进行表达.方法 将设计的LIMK1的siRNA的寡聚脱氧核苷酸链与真核表达载体pSUPER连接,构建重组pSUPER-LIMK1真核表达载体,并将其转染入MG63细胞株中.采用RT-PCR检测pSUPER-LIMK1质粒转染后LIMK1在人成骨肉瘤中的基因表达,Western blot检测LIMK1蛋白的表达.结果 构建的真核表达载体pSUPER-LIMK1可在人成骨肉瘤MG63细胞中的表达.结论 构建的人LIMK1-siRNA蛋白的真核表达载体pSUPER-LIMK1,为进一步骨肉瘤基因靶向治疗的研究奠定了基础.

淀粉样前体蛋白-C端片段对胚鼠原代皮层神经元cofilin磷酸化的影响

目的 探讨淀粉样前体蛋白-C端游离片段(APP-CTFs)对ADF/cofilin的影响及作用机制.方法 APP-CT99-pEGFP转染胎鼠原代皮层细胞,采用细胞免疫组化方法和蛋白印迹方法观察磷酸化cofilin和LIMK1的分布形态和表达水平.处理S3肽,LIMK1的特异性竞争性抑制剂后再观察磷酸化cofilin表达.结果 细胞免疫组化实验结果,转染APP-CT99-pEGFP的细胞中,磷酸化cofilin和LIMK1在细胞质和细胞核中均有分布,与空载体转染组比较分布较高.S3肽处理后,磷酸化cofilin的表达水平减少.蛋白印迹实验结果,转染APP-CT99-pEGFP的细胞中,磷酸化cofilin和LIMK1蛋白水平增高,与空载体转染组比较具有显著性差异(P＜0.05).S3肽处理后,磷酸化cofilin蛋白水平降低.结论 APP-CTFs通过LIMK1激酶调控cofilin磷酸化.

人LIMK1基因荧光真核表达载体的构建及在人成骨肉瘤MG63细胞中的表达

目的 构建并表达人LIMK1与绿色荧光蛋白(EGFP-C1)的融合蛋白EGFP-LIMK1,并监测其在人成骨肉瘤MG63细胞内的表达及活性.方法 利用基因重组技术将LIMK1与绿色荧光蛋白融合并构建真核细胞表达质粒,通过脂质体介导法导人人成骨肉瘤MG63细胞内,用荧光显微镜观察LIMK1基因表达情况,通过Westernblot检测其在MG63细胞中的活性.结果 双酶切鉴定证实LIMK1片段已克隆到pEGFP-C1载体的Kpn Ⅰ和Not Ⅰ位点之间,测序结果证实了插入片段的正确性,转染MG63细胞后,利用荧光显微镜观察可见到绿色荧光蛋白的表达;Western blot检测证实LIMK1在MG63细胞中活性上调.结论 成功构建了含有绿色荧光蛋白基因的LIMK1真核表达载体并检测到其在真核细胞MG63中的表达及活性.

LIMK1与恶性肿瘤的研究现状

LIMK1是LIM激酶(LIM kinase,LIMK)蛋白家族两大成员之一,生理功能主要是把Cofilin磷酸化使它成为失活的pCofilin,进而参与细胞肌动蛋白骨架的重新组合,体内有很多种机制调控着LIMK1的活化,活化的LIMK1起着桥梁的作用,是连接细胞外刺激与细胞骨架稳定性的纽带[1].近年来的研究发现证实LIMK1对肿瘤细胞的迁移及侵袭性有着重要的调节作用,它有可能是引起肿瘤细胞侵袭和转移的关键分子之一[2-3].本文对LIMK1的结构功能以及参与肿瘤耐药细胞迁移以及信号通路的调控做一综述.

胃癌中LIMK1的表达及其病理意义

目的 探讨LIMK1在胃癌中的表达及其临床病理意义.方法 应用组织芯片与免疫组织化学SP法检测81例胃癌、26例不典型增生及34例正常组织中LIMK1的表达水平,分析其与胃癌临床分期、有无淋巴结转移等临床病理特征的关系.结果 LIMK1在正常组织、不典型增生与胃癌中表达呈递增趋势(P<0.05);弥漫型胃癌阳性率明显高于肠型胃癌(P<0.05).肿瘤直径≤3.0 cm的胃癌中LIMK1的表达明显低于＞3.0 cm的表达(P<0.05);淋巴结转移组表达明显高于未转移组(P<0.05).TNM分期Ⅲ、Ⅳ期表达明显高于Ⅰ、Ⅱ期(P<0.05);LIMK1表达与患者性别差异无显著性(P>0.05).结论 LIMK1与胃癌的分化程度、肿瘤大小、淋巴结转移、临床分期密切相关,可能是胃癌侵袭转移重要的生物标记物.

沉默LIMK1促进DADS抑制SW480细胞迁移与侵袭

目的 探讨LIMK1沉默对DADS抑制SW480细胞迁移与侵袭的影响.方法 RNA干扰技术建立稳定LIMK1-miRNA/SW480细胞株;免疫组化和Western blot检测DADS对沉默LIMK1结肠癌SW480细胞LIMK1和磷酸化LIMK1蛋白表达的影响.划痕实验和侵袭实验检测LIMK1 RNA沉默与DADS对SW480细胞迁移与侵袭的影响.结果 RT-PCR与Western blot显示,LIMK1-miR/SW480细胞LIMK1mNRA与蛋白表达明显下调,表明成功构建稳定沉默LIMK1基因的SW480细胞株.免疫组化和Western blot显示,45 mg· L-1 DADS处理和沉默LIMK1组较未转染组与空载体组SW480细胞LIMK1蛋白和磷酸化LIMK1明显下调 (P<0.05).划痕实验和侵袭实验发现,沉默LIMK1或DADS处理SW480细胞的迁移与侵袭能力较未转染组与空载体组明显抑制 (P<0.05).而DADS处理沉默组抑制SW480细胞迁移和侵袭能力更为明显 (P<0.05).结论 沉默LIMK1基因可抑制SW480细胞迁移与侵袭,增强DADS抑制SW480细胞迁移与侵袭作用.

二烯丙基二硫下调LIMK1抑制人胃癌MGC803细胞迁移与侵袭

目的 研究二烯丙基二硫(diallyl disulfide,DADS)对人胃癌MGC803细胞迁移侵袭及LIMK1表达的影响.方法 MTT、划痕愈合和侵袭实验分别检测DADS对MGC803细胞增殖、迁移与侵袭能力的作用;RT-PCR、Western blot与免疫细胞化学检测LIMK1表达.结果 MTT显示,30 mg· L-1 DADS作用MGC803细胞24、48、72、96 h后,增殖抑制率分别为31.8%、66.1%、83.6%、89.2%,呈明显的时间依赖关系(P<0.05).划痕实验显示,10、20、30、40、50 mg·L-1 DADS分别作用 MGC803 细胞,划痕愈合明显慢于对照组,呈剂量依赖关系(P<0.05).侵袭实验显示,10、20、30、40、50 mg·L-1 DADS作用MGC803细胞24 h后,穿过基质胶的细胞数分别为(35.8±3.74)、(34.1±2.02)、(31.7±4.81)、(17.2±3.08)、(13.2±3.36)个,较对照组(39.5±2.99)个数明显减少,呈剂量依赖性(P<0.05).RT-PCR显示,30 mg·L-1 DADS与MGC803细胞作用48 h后,LIMIK1 mRNA明显下调(P<0.05).Western blot与免疫细胞化学检测显示,30 mg·L-1 DADS作用MGC803细胞6、12、24、48 h后,LIMK1蛋白的表达水平呈时间依赖性下降(P<0.05).结论 DADS可抑制人胃癌MGC803细胞迁移与侵袭能力,其机制可能与下调LIMK1有关.

LIM K1表达与结肠癌患者临床病理特征的关系

目的：探讨LIMK1表达和结肠癌患者临床病理特征的关系。方法将68例结肠癌、17例上皮内瘤变及31例正常结肠组织共116例结肠标本制成组织芯片，采取免疫组织化学技术检测标本中LIMK1的表达水平。结果LIMK1在结肠癌中的表达水平显著高于健康组织。 LIMK1表达与结肠癌肿瘤大小、淋巴结转移、TNM分期有关（ P＜0．05），但与患者的年龄、分化程度无关。结论 LIMK1表达与结肠癌的发生发展密切相关，可能是结肠癌侵袭转移的重要标志。

LIMK1在结肠癌组织中表达的临床病理意义

目的 研究LIMK1表达与结肠癌发生、分化程度、肿瘤大小、淋巴结转移、临床分期的关系.方法 将87例结肠癌、26例腺瘤及34例正常结肠组织共147例结肠标本制成组织芯片,采用免疫组织化学技术检测结肠癌、腺瘤及正常组织中LIMK1表达.结果 HMK1在腺癌组织中表达[75.86％ (66/87)]明显高于在腺瘤[38.46％ (10/26)]与结肠正常黏膜[20.58％ (7/34)]组织中的表达(P＜0.005),而腺瘤组织中的表达高于正常黏膜组织(P＜0.05).高分化结肠癌组织中LIMK1表达率[40.00％(4/10)]明显高于中分化结肠癌组织中的表达率[70.21％ (33/47)]与低分化腺癌结肠癌组织中的表达率[96.67％ (29/30)] (P＜0.05),而中分化结肠癌组织中的表达率显著高于低分化腺癌(P＜0.05).体积＜5.00cm结肠癌组织LIMK1表达[57.14％ (20/35)]明显低于≥5.0 cm的表达[88.46％ (46/52)] (P＜0.05).淋巴结转移表达97.78％ (44/45)显著高于无淋巴结转移的表达[52.38％(22/42)](P＜0.05).Dukes分期A+B组LIMK1表达[60.98％ (25/41)]明显低于C+D组[89.13％(41/46)](P＜0.05).结论 LIMK1表达与结肠癌的发生、分化程度、肿瘤大小、淋巴结转移、临床分期密切相关,其可能是结肠癌侵袭转移的重要标志.

LIMK1在结肠癌中表达与沉默对人结肠癌细胞迁移与侵袭的影响

目的探讨LIMK1在结肠癌中的表达与临床病理参数的关系和沉默LIMK1对人结肠癌SW480细胞迁移与侵袭的影响。方法免疫组化检测LIMK1在结肠癌表达；RNA干扰建立LIMK1-miR/SW480细胞株；RT-PCR与Western blot分别检测LIMK1 mNRA与蛋白及磷酸化LIMK1表达；划痕实验和侵袭实验检测沉默LIMK1对SW480细胞迁移与侵袭的影响。结果免疫组化显示,LIMK1在结肠癌中表达明显高于结肠正常组织,高分化腺癌表达明显低于中分化与低分化腺癌,而低分化高于中分化腺癌；<5.0 cm的结肠癌表达明显低于≥5.0 cm；淋巴结转移显著高于无转移；Dukes分期A+B组表达明显低于C+D组(P<0.05)。 RT-PCR与Western blot显示,LIMK1-miR/SW480细胞LIMK1 mNRA与蛋白表达明显下调,表明成功构建稳定沉默LIMK1基因的SW480细胞。免疫细胞化学证实,沉默组LIMK1表达较未转染组与空载体组明显降低。 Western blot显示,沉默组LIMK1和磷酸化LIMK1较未转染组与空载体组明显下调(P<0.05)。划痕实验显示,沉默组癌细胞迁移率(22.53%)较对照组(76.50%)与空载体组(72.14%)明显降低(P<0.05)。侵袭实验发现,沉默组穿膜细胞(43.67依1.51个)较未处理组(143.33依1.52个)与空载体组(136.34依1.53个)明显减少(P<0.05)。结论 LIMK1表达与结肠癌发生、大小、淋巴结转移及Dukes分期有关。沉默LIMK1基因可抑制人结肠癌SW480细胞迁移与侵袭。

缺氧预处理新生大鼠缺氧缺血脑组织中Limk1蛋白表达

目的:观察Limk1蛋白在缺氧预处理后不同时间段新生大鼠缺氧缺血和对照组脑组织中的表达差异.方法:采用7日龄SD大鼠54只,随机分为于单纯缺血缺氧组18只,假手术对照组18只,缺氧预处理组18只.各组再分为处理后0h、1d、7d组,每组各6只.用免疫组化法检测观察Limk1在不同组脑组织各部位的表达差异.结果:Limk1蛋白阳性神经元在各组的吸光度:单纯缺血缺氧组0 h(21.658±3.990)、1 d（30.369±5.156）、7 d(41.546±5.677)；缺氧预处理组0 h(30.261±4.266)、1 d(43.129±5.785)、7 d(56.309±7.198)；假手术组0 h(14.113±2.983)、1 d(16,098±3.116)、7 d(15.983±3.009).在单纯缺血缺氧组及缺氧预处理组脑组织的表达比假手术组增多(P＜0.01).在同一时间段上,缺氧预处理组比单纯缺血缺氧组Limk1的表达明显增多（P＜0.01）.同样在缺血缺氧后,无论是单纯缺血缺氧组还是缺氧处理组,Limk1的表达随着0h、1、7d的推移表达渐增多(P＜0.05).结论:缺氧预处理能够增加新生大鼠缺血缺氧性脑组织中Limk1的表达,其提示缺氧预处理后的新生大鼠缺血缺氧的脑组织可能存在更强的神经重塑作用.

Limk1在FMR1基因敲除小鼠脑组织的表达及意义

目的:通过免疫组化方法观察LIM-kinase 1(Limk1)在不同年龄组的FMR1基因敲除鼠(FMR1 knockout mouse,KO)和野生鼠(wild type mouse,WT)脑组织不同部位的表达差异.方法:取FVB品系新生和生后2、6周KO鼠(KO0d、KO2周和KO6周),并分别与同龄WT鼠作对照.每组6只通过免疫组化染色,观察Limk1在不同年龄组的KO和WT小鼠脑组织各部位的表达差异.结果:Limk1在新生鼠的海马、皮层、丘脑、小脑表达丰富,以染色阳性纤维为主,染色阳性细胞少见.生后2周、6周小鼠的大脑皮质和海马仅见少量散在弱阳性细胞表达,但在丘脑未定带、腹后外侧核,小脑蒲肯野细胞和脑干前庭蜗神经核可见强阳性细胞表达.各年龄组KO与WT小鼠Limk1在脑区的分布特点基本一致.KO0d、KO2周及KO6周组小脑、蜗神经核Limk1强阳性表达脑区的平均光密度值以及KO2W及KO6W组丘脑部位的阳性细胞计数均高于同龄WT组,差异有统计学意义(P＜0.05).结论:Limk1在KO与WT小鼠脑组织的表达均有着明显的时空特异性,FMRP能负性调控Limk1表达.