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基于转录组测序的山茱萸次生代谢生物合成相关基因的挖掘
为探讨山茱萸中环烯醚萜等次生代谢产物合成的遗传基础,采用新一代高通量测序技术对其果实进行转录组测序,共获得得96 032条unigenes,平均长度590.53 bp;其中共有35 478条unigene能被NR,Swissprot,COG,GO,KOG,Pfam和KEGG等7个公共数据库注释.通过对注释所得的unigene进行KEGG代谢通路的分析发现,共有84个unigene与环烯醚萜类成分的生物合成有关;487条unigene参与山茱萸其他次生代谢相关物质代谢调控.研究发现,共有153条unigene参与山茱萸次生代谢产物的氧化/羟基化;72条unigene参与次生代谢产物的糖基化.该研究首次对山茱萸转录组进行了分析,并获得了山茱萸环烯醚萜类等次生代谢生物合成相关的候选基因,为山茱萸的分子生物学研究提供了丰富的数据资源,也为后续探讨候选基因的功能奠定了基础.
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基于高通量测序的药用植物"凤丹"根皮的转录组分析
牡丹皮为我国传统常用中药,安徽省铜陵地区栽培的"凤丹"根皮加工而成的药材牡丹皮被誉为道地药材,药用活性成分丰富多样,但目前尚不清楚 "凤丹"药用部位次生代谢过程中活性物质合成的遗传学基础.研究采用Illumina HiSeq 4000高通量测序平台对五年生"凤丹"根皮转录组进行测序,对测序结果进行de novo 拼接和功能注释,测序后获得72 997条unigene.进一步利用公共数据库进行同源比对,其中41 139条unigene被Nr数据库成功注释,34 952条unigene能被GO数据库成功注释,20 016条unigene被KEGG数据库成功舒注释,共涉及到5个大类、34个种类、352条代谢通路;在次生物质合成与代谢途径中,其中苯丙素类化合物、萜类化合物骨架合成、各种类型萜类化合物、生物碱类化合物以及黄酮类成分生物合成途径中的unigene分别有214,104,152,55,36个;不同产地样本间差异表达基因的富集性比较显示不同产地样本间存在明显差异;此外,在72 997条unigene中共检测到9 939个SSR序列,其中二核苷酸重复的SSR标记占20.75%.研究的结果不仅为挖掘"凤丹"次生代谢物生物合成关键基因提供了基础数据信息,也为药用牡丹的遗传多样性研究和分子标记开发奠定了分子基础.
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茉莉酸甲酯对颠茄托品烷类生物碱代谢及相关基因表达的影响
莨菪碱和东莨菪碱是颠茄中重要的托品烷类生物碱次生代谢产物,具有多方面药理价值.该研究采用土培法种植颠茄实生苗,设置不同浓度茉莉酸甲酯(MeJA)处理,分析不同浓度MeJA对颠茄莨菪碱和东莨菪碱的含量、生物碱合成的上游物质以及关键酶基因表达量的影响.结果表明,MeJA浓度为200 μmol·L-时更有利于颠茄生物碱的积累;对腐胺(Put)及其合成的关键酶活性的测定发现,Put的含量与其合成的关键酶活性的变化基本一致,都随MeJA浓度升高先增加后降低,Put含量在MeJA浓度为200 μmol·L-1时达到高;对PMT,TRⅠ,H6H表达量的检测发现,200 μmol· L-MeJA处理下叶片和根部TRⅠ,H6H基因均有较高的表达水平,PMT基因表达量无明显变化趋势.以上结果说明,MeJA对颠茄莨菪碱和东莨菪碱合成的调控主要依靠影响关键酶基因的表达量发挥效用,适宜浓度茉莉酸甲酯提高了颠茄叶片TR Ⅰ和根部TR Ⅰ与H6H表达量,从而促进莨菪碱的合成和莨菪碱向东莨菪碱的转化,提高颠茄体内莨菪碱和东莨菪碱的积累.
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药用植物代谢组学研究
代谢组学是全局性研究小分子代谢物的一门科学,是系统生物学的重要组成部分,广泛应用于中医药复杂体系.代谢物是药用植物代谢合成的产物,是中药发挥疗效的物质基础.随着本草基因组计划的实施和中药合成生物学的发展,药用植物代谢组学研究将会迎来蓬勃发展.该文介绍代谢组学技术近几年的研究进展,以及药用植物代谢组学研究的主要内容,包括药用植物鉴别和质量评价,品种选育和抗逆研究,代谢途径解析,代谢网络、代谢工程研究及合成生物学研究.通过整合本草基因组,转录组和代谢组学等研究,终为药用植物品种选育、创新药物研发和质量安全性评价奠定基础.
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氮素形态对颠茄生物碱积累及相关基因表达的影响
莨菪碱和东莨菪碱是颠茄含有的2种主要生物碱,具有重要的药用价值.该研究以颠茄实生苗为材料,设置不同铵硝配比处理,分析不同形态氮素对颠茄莨菪碱和东莨菪碱的含量和生物碱合成的上游产物、信号分子以及关键酶基因表达量的影响.结果显示,铵硝比50∶50更有利于颠茄生物碱的积累和莨菪碱向东莨菪碱的转化.对Put及其合成关键酶的检测发现,腐胺的含量与腐胺合成的关键酶活性变化基本一致,它们都随铵态氮比例的增加而升高,在铵硝比75∶25达到高;对信号分子NO的检测发现,NO浓度随处理液中硝态氮比例的减小而减小;对PMT,TRⅠ,H6H表达量的检测发现,少量铵态氮增加了根部PMT,H6H基因表达量,铵硝比为50∶50时叶片和根部PMT,TRⅠ,H6H基因都有较高的表达水平.以上结果表明,氮素形态对颠茄莨菪碱和东莨菪碱合成的调控主要通过影响关键酶基因的表达量起作用,铵硝等比供氮条件提高了颠茄叶片中TRⅠ和根部PMT与H6H表达量,因此促进了腐胺向莨菪碱的合成以及莨菪碱向东莨菪碱的转化,使颠茄能够积累更多的莨菪碱和东莨菪碱.
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中药指纹图谱在新药开发中的作用
中药指纹图谱是借助于波谱或色谱技术获得的中药(主要是植物药)次生代谢化学万分的光谱图或色谱图.
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RNA-Seq与道地药材研究
RNA-Seq是一种新崛起的转录组学研究方法,利用新一代测序技术能够更为准确、快速地为人们提供更多的生物体转录信息,已广泛应用于多种生物领域.道地药材以质优、疗效好的优势历来被各医家所推崇,其道地性形成的根本是其基因型在特定时空表达的产物.因此通过转录组测序来解析其生物合成机制,已成为当前药用植物次生代谢研究的热点.本文主要介绍了RNA-Seq技术及其优势,并就其在道地药材形成机制研究方面的应用进行了讨论,为今后该技术的研究与应用提供参考.
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西洋参PqERF1基因的克隆和生物信息学分析
乙烯响应因子(ethylene responsefactor,ERF)是具有PETALA2(AP2)结构域的转录因子.本研究通过西洋参(Panax quinquefolius L)的转录组高通量测序结果分析获得75条具有AP2结构域的转录因子序列,并克隆到一条开放阅读框为933对碱基的基因序列,定名为PqERF1.基因表达分析结果表明PqERFl基因受茉莉酸甲酯(MeJA)的诱导,这与人参皂苷含量的受诱导模式相同.蛋白结构预测结果表明PqERF1是定位于细胞核的具有完整保守的AP2结构域的转录因子,InterproScan蛋白功能结构域分析结果表明PqERFl很可能为发病机制相关蛋白;序列比对和进化关系分析结果也显示PqERFl与发病机制相关蛋白(烟草NtERF4)、次生代谢产物相关合成蛋白(野胡萝卜DcERFl)和花衰老相关蛋白(矮牵牛PhERFl2)的相似性高,且系统进化关系较近.因此,推测PqERFl基因可能是参与西洋参次生代谢产物合成调节、抗病性和衰老相关的重要基因.
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真菌诱导子对滇重楼中次生代谢产物甾体皂苷的影响
为了研究比较接种和不接种丛枝菌根(AM)真菌对滇重楼根茎中甾体皂苷类成分的影响,通过室温盆栽接种试验,采用高效液相色谱法测定并比较收获滇重楼根茎中甾体皂苷类成分的差异.结果显示,不同AM真菌对滇重楼根茎中次生代谢产物甾体皂苷的影响存在差异.AM真菌诱导子处理后,没有改变滇重楼根茎的化学背景,但能部分提高其根茎中化学成分的含量.实验结果表明,AM真菌与滇重楼之间具有选择性,根内球囊霉是适宜滇重楼接种的优良菌种.
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三七PnUGT1基因的全长cDNA克隆和生物信息学分析
本研究通过对三七的转录组高通量测序结果进行分析,采用5'-RACE和RT-PCR方法,对其中一条可能参与三萜皂苷合成的UDP-糖基转移酶基因转录本(Pn02086)进行全长克隆,预测了该基因编码蛋白的理化性质、保守结构域等,并对其进行了进化分析.通过全长克隆,得到一条开放阅读框为1488 bp的cDNA序列,命名为PnUGT1,GenBank登录号JX018210.该基因编码495个氨基酸,蛋白分子量为55.453kD,属于不稳定蛋白.二级结构中α-螺旋占36.16％、β-折叠占11.31％、无规卷曲占52.53％.InterProScan预测该蛋白具有7个保守结构域,包括在植物次生代谢产物中相关糖基转移酶特有的PSPG保守基序.该蛋白不具有信号肽和跨膜区,有可能定位在细胞质中.序列比对和进化关系分析表明,该蛋白和蒺藜苜蓿三萜合成相关的UDP-糖基转移酶AAW56092的亲缘关系较近,PSPG保守区域的相似性为66％.该基因在三七叶中表达量较在花、茎和根中的表达量高.推测PnUGT1基因可能参与了三七皂苷的合成.
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真菌诱导子对药用植物细胞培养产生次生代谢产物影响的研究
目的 介绍近年来真菌诱导子对药用植物细胞培养产生的次生代谢产物的影响.方法 检索国内外相关资料进行汇总,分析,依据次生代谢产物的合成途径进行分类和综述.结果 总结了真茵诱导子对药用植物次生代谢产物及其代谢途径的影响规律及特点.结论 植物的次生代谢产物合成的途径,可能受到真茵诱导子的影响,真菌诱导子的种类、使用的方法和剂量等的不同,对植物的代谢途径的影响表现出差异.对真菌诱导子影响植物代谢途径的全面考察,真菌诱导子的有效部位和有效成分,作用机制及调控基因的表达都有待进一步研究.
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紫外线-B诱导桑叶中次生代谢产物变化及其差异蛋白质组学研究
目的 考察紫外线-B(UV-B)诱导下不同暗培养时间对桑叶中两种次生代谢产物的影响及诱导前后差异蛋白组学研究.方法 以高效液相色谱法建立UV-B诱导前后桑叶甲醇提取物的指纹图谱,并对其中的两种次生代谢产物进行定量分析;利用透射电镜观察UV-B诱导下桑叶亚细胞结构的变化;以双向电泳技术对UV-B诱导前后的桑叶进行差异蛋白质组学分析.结果 在UV-B诱导下,桑叶的亚细胞结构受到严重破坏,桑叶中桑辛素N和查桑酮的含量随着暗培养时间的增加而增加,分别在暗培养36和40 h达到大值;差异蛋白质组学结果发现黄酮合成途径中查尔酮合酶的表达量显著升高.结论 UV-B诱导联合暗培养的胁迫方式,改变了桑叶体内次生代谢过程特别是黄酮生物合成途径,致使桑辛素N和查桑酮的大量合成.
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不同产地丹参中淀粉与有效成分含量的比较
目的 建立一种丹参淀粉含量检测方法,测定不同产地样品淀粉含量,分析淀粉与有效成分含量间的关系.方法 采用高氯酸-蒽酮比色法测定丹参植物干燥根中淀粉含量,进行方法学考察,并测定山东、河南、四川3个产地20株丹参样品,同时采用超高效液相色谱(UPLC)方法对样品中8种有效成分进行测定,分析二者的相关性.结果 建立了一种丹参植物干燥根淀粉含量测定方法.该方法在0～50 mg/L内具良好的线性关系,具有良好的精密度、重复性和加样回收率,RSD均小于3％,方法准确可靠;不同产地丹参样品中淀粉的含量与丹参酮类成分呈正相关趋势,与丹酚酸类成分呈负相关趋势.结论 丹参根中淀粉的积累与有效成分的代谢密切相关.
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龙骨马尾杉PcFPS1基因克隆及序列分析
目的 对龙骨马尾杉Phlegmariurus carinatus法呢二磷酸合成酶(Farnesyl diphosphate synthase,FPS)基因PcFPS1编码区进行克隆及序列分析.方法 根据已获得的龙骨马尾杉转录组数据,从中获得1条编码FPS的转录本,采用RT-PCR方法获得PcFPS1的编码区序列,并对PcFPS1蛋白进行理化性质、蛋白二级结构及三维结构预测分析.结果 序列分析表明,所克隆的PcFPS1基因编码区长为1 119 bp,编码372个氨基酸残基,PcFPS1与挪威云杉Picea abies的FPS具有70％的序列相似性.生物信息学预测PcFPS1蛋白基本不含跨膜区,具有萜类合酶保守结构域,不含信号肽.结论 首次获得龙骨马尾杉PcFPS1基因的编码区序列,为进一步研究PcFPS1在石杉科植物萜类及甾醇类化合物生物合成途径中的功能及鉴定酶活性位点奠定基础.
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酵母前体饲喂验证植物次生代谢产物功能基因方法学初探
目的 筛选效率高的酵母前体饲喂方式,为在酵母中进行基因功能验证提供方法学指导.方法 首先构建含PsP6H基因和PsCPR基因重组酵母工程菌,然后用4种不同的方法进行前体饲喂,后质谱检测下游产物二氢血根碱来确定优方案.结果 优的前体饲喂方法是将酵母工程菌经过半乳糖诱导31h后在pH 8.0的Tris EDTA溶液中孵育24 h.结论 不同的前体饲喂方式对酵母工程菌下游产物产生不同影响,经优化后的酵母前体饲喂方法较稳定,重复性好.
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基于Illumina HiSeq 2000测序技术对当归根的转录组特性研究
目的 识别当归Angelica sinensis根药用活性物质的基因序列,阐释当归次生代谢产物生物合成的遗传基础.方法 从当归头、当归尾提取总RNA,质量鉴定合格后构建测序文库.测序文库检测合格后在Illumina HiSeq 2000测序仪上完成双端测序.采用相关生物信息学方法分析当归根的转录组特性.结果 采用Illumina HiSeq 2000高通量测序获得当归根转录组的66 431 540个原始短读序.用生物信息学方法从头组装并注释了30 432个功能基因序列(unigene).应用Uniprot蛋白数据库进行序列相似性比对,当归功能基因序列主要分布于目前研究较深入的7种重要经济作物,如葡萄、蓖麻、毛果杨、大豆、苜蓿、拟南芥和烟草.研究发现,当归根表达的127、69、70、94个unigene分别映射到类苯基丙烷生物合成、N-聚糖生物合成、黄酮类化合物生物合成和叶酸生物合成等路径,可能参与药用活性物质阿魏酸、当归多糖、当归总黄酮和叶酸的生物合成.结论 参与当归根重要药效物质(阿魏酸、当归多糖、当归总黄酮等)生物合成的功能基因序列可能是当归补血、活血功效的分子生物学基础.
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喜树碱生物合成途径及其相关酶的研究进展
喜树碱是我国特有植物喜树中分离得到的具有显著抗癌活性的重要次生代谢产物,利用生物技术大量生产喜树碱类抗癌药物是目前研究的热点.喜树碱生物合成途径是多酶催化的复杂过程,阐明喜树碱的生物合成机制,对应用代谢工程的策略调控代谢流量,使次生代谢朝喜树碱合成的方向进行至关重要.喜树碱有着与其他萜类化合物相同的上游合成途径,以及广泛的药物来源,因此弄清喜树碱合成机制对理解整个植物次生代谢的网络调控也具有重要意义.综述喜树碱的生物合成途径、相关酶及其表达调控,并对喜树碱的合成研究进行展望.
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RNAi载体构建新方法及其在植物次生代谢调控中的应用
RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术具有专一性强、抑制效率高、可大规模操作、重复性好及在植物中可以孟德尔方式遗传等优点,被广泛应用于基因功能验证、代谢调控等方面.在植物代谢工程中,可通过RNAi方法抑制分支途径产物合成及改变代谢流的分配,调控目标物质的合成.对RNAi技术发生机制、高效RNAi载体构建方法及其在代谢调控中的应用进展进行系统概述,以期为利用RNAi技术进行代谢工程调控研究奠定理论基础和提供技术参考.
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药用植物生物碱次生代谢工程研究进展
药用植物次生代谢途径及其调控机制的研究基础薄弱,阻碍了代谢工程在获取高价值次生代谢产物的广泛应用.生物碱是存在于药用植物中的一类含氮杂环化合物,具有抗肿瘤、抗微生物、降血压、解痉镇痛等药理作用,备受研究者的关注.应用代谢工程手段改善代谢途径,提高次生代谢产物的量,对优化药用植物种质资源以及可持续发展具有重要价值.通过对药用植物生物碱类化合物的代谢合成途径进行综述,并讨论生物碱代谢工程的研究方法和调控策略,为药用植物生物碱相关研究提供参考.
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植物萜类物质生物合成的相关转录因子及其应用前景
植物萜类化合物具有很高的经济价值和药用价值.近年来,开始利用转录因子来提高萜类次生代谢物的产量.转录因子在萜类次生代谢生物合成中起着重要的作用,通过与结构基因的结合,转录因子可激活次生代谢合成途径中多个基因协同表达,从而有效启动次生代谢途径；转录因子还可激活不同植物中相似萜类次生代谢合成基因的表达,将从特定植物中分离出来的转录因子基因在不同植物中进行遗传转化,可以有效提高转基因植物中萜类物质的量.因此,转录因子的应用是萜类次生代谢基因工程中的一个新方向,已显示出广泛的应用前景.介绍了萜类次生代谢途径相关的重要转录因子:AP2/ERF、WRKY、bZCT、bHLH及其在萜类生物合成遗传改良中的研究进展.
