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加热白云石粉体外抗病毒的实验研究
本研究通过白云石粉和三种病毒吸附孵育,探究其体外抗病毒效用.将RSV病毒、HSV-Ⅰ病毒、EV-71病毒同加热后的白云石粉在37℃孵育1h,进行体外抗病毒实验,MTT染色后测量其吸光度,计算各病毒的TCID50及经孵育处理病毒的TCID50.结果显示,通过测定得出经白云石粉孵育后,3种病毒毒力均有下降,其中EV-71病毒毒力下降1 258.92倍.加热白云石粉末具有体外抗病毒效果.
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鸡传染性法氏囊病毒实时qRT-PCR检测方法的建立及初步应用
根据高效培养鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)时对病毒滴度检测的需要,本文针对IBDV VP4基因的保守序列设计并合成了一对引物,以所构建的重组质粒作为阳性标准品,建立了检测IBDV核酸载量的SYBR Green I荧光定量实时RT-PCR(qRT-PCR)方法,结果表明,其Ct值与标准品模板在4.03×101～109拷贝/μL范围内呈良好的线性关系,对IBDV核酸的低检出量为40拷贝/μL,灵敏度是常规RT-PCR检测方法的1 000倍；该方法不与其它禽源病毒发生交叉反应,批内变异系数小于0.5％.应用本方法对DF-1细胞中IBDV的增殖滴度进行了测定,并与经典的TCID50测定方法进行了比较.结果显示两种方法测定的IBDV在微载体悬浮培养和方瓶静态培养条件下DF-1细胞上的增殖曲线都具有一定的平行关系,且qRT-PCR方法比TCID50方法更加快速和敏感,更适合于对IBDV增殖滴度的实时快速测定.
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J亚群禽白血病病毒NX0101株的TCID50与p27抗原之间的相关性研究
为了研究J亚群禽白血病病毒在细胞上接种后的半数细胞培养物感染量(TCID50)与p27抗原的酶联免疫吸附试验(ELISA)的S/P值之间的相关性,并探讨其意义.本试验将J亚群禽白血病病毒NX0101株接种鸡胚成纤维细胞(CEF细胞),换维持液后连续10d取样,检测10d的TCID50值与p27抗原的S/P值之间的相关性.同时,将该毒株在DF-1细胞系上传代至20代,取其中的第1代、第5代、第10代、第15代和第20代分别进行TCID50滴度的测定和p27抗原检测.结果表明:在CEF细胞上接种的NX0101株J亚群禽白血病病毒连续10d的TCID50值与p27抗原之间存在显著的相关性(r=0.85277;P＜0.0001)呈正相关；在DF-1细胞系上传的不同代数之间也呈显著正相关(r=0.93000;P=0.0220).由此可以推测J亚群禽白血病病毒的TCID50与p27抗原呈显著正相关,因而可以用ELISA法测得的p27抗原的S/P值对病毒的TCID50值进行估测.
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检测DENV-2活病毒含量RTCA标准曲线法的建立
目的 利用实时无标记细胞分析系统(real-time cellular analysis,RTCA)建立半数细胞指数时间(CIT50)与病毒滴度(TCID50)相关性的标准曲线,评估RTCA技术在监测2型登革病毒(DENV-2)感染BHK细胞后引发细胞病变效应(CPE)中的可行性和应用价值. 方法 检测不同培养条件下BHK细胞的CI值变化,筛选合适的初始细胞接种密度及血清浓度;应用RTCA分析已知不同TCID50滴度DENV-2感染BHK细胞的CIT50值,构建CIT50-TCID50标准曲线,计算回归方程;收集DENV-2感染C6/36细胞后第1～4 d的培养上清(D1,D2,D3,D4),利用RTCA法和TCID50法分别检测上清中DENV-2滴度,分析CIT50-TCID50标准曲线法的灵敏度和可行性. 结果 BHK细胞以初始接种密度为2×101个/孔,血清浓度为2％的培养条件为佳;不同滴度DENV-2感染后BHK细胞的生长曲线均左移,CIT50与TCID50间呈线性负相关,线性方程为y=-7.007x+75.546(R2 =0.9854);不同时间感染C6/36细胞培养上清中病毒含量(logTCID50/mL):RTCA标准曲线法为4.90±0.05(D2)、6.18±0.20(D3)、6.04±0.10(D4);传统TCID50法为0(D1)、6.25±0.49(D3)、5.87±0.35 (D4). 结论 利用RTCA技术建立的CIT50-TCID50标准曲线法,可用于已知DENV-2在BHK细胞的定量检测,结果较TCID50法更客观,且该法操作便捷且灵敏度高,为评估DENV-2感染性活病毒颗粒的毒力提供了新的技术手段.
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消毒剂灭活流感病毒方法的探讨
目的以含氯消毒剂对甲型流感病毒灭活试验效果的观察,探讨消毒剂杀灭病毒试验方法.方法试验采用细胞感染法,以活细胞染色法(MTT法)和观察细胞病理变化(CPE)法测定中和剂、消毒剂及中和产物对狗肾细胞(MDCK)存活性的影响;通过流感病毒对细胞感染情况的观察、计算半数细胞感染剂量(TCID50)的值,确定消毒剂对病毒的杀灭效果. 结果含氯消毒剂有效氯含量25 mg/L时,作用于细胞,仍可影响细胞的存活性,以MTT法测定,细胞存活率仅为26.15%,与CPE法测定含氯消毒剂对狗肾细胞存活性影响的结果基本一致;用MTT法筛选出的含0.07% 硫代硫酸钠的PBS的中和剂,可作为含氯消毒剂杀灭甲型流感病毒试验的中和剂;有效氯含量400 mg/L、作用10 min,对甲型流感病毒的平均杀灭率为99.91%.结论以细胞感染法确定消毒剂对病毒杀灭效果的试验方法简便、可行.
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Celltiter-Glo ATP荧光活性检测在登革病毒1型中和试验中的应用
目的 利用Celltiter-Glo ATP荧光活性检测方法(CTG法)在登革病毒1型(DENV1)中和试验中的实验研究,探索出新的组织培养中和试验结果判断方法.方法 DENV1病毒与抗DENV1多克隆抗体进行中和试验感染Vero细胞,选择CTG法和传统的显微镜观察法判断CPE的程度,比较两种方法对细胞半数致死量(TCID50)和中和指数的判定,确定CTG法的准确性.结果 显微镜观测TCID50=5.5,CTG法TCID50=5.31;显微镜观测、CTG检测法均为10-2.1为中和终点,两种方法获得的中和指数较一致.结论 CTG法可作为DENV1细胞组织培养中和试验的结果判断,并能减少实验结果评定中的人为误差.
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木鱼石对细胞生长影响实验及其抗病毒实验研究
目的 通过使用被不同产地木鱼石浸泡过的细胞培养液进行细胞培养,观察和记录细胞的生长形态和数目,总结出其对细胞生长的影响情况.并使用佳样品木鱼石粉末和病毒吸附孵育,研究其抗病毒效用.方法 通过与青石浸泡过的以及正常的培养液作对照,找出有益细胞生长的样品.并进行体外抗病毒实验,观察细胞病变,MTT染色后测量其吸光度,计算病毒的TCID50,分析供试品抗病毒效果.结果 经过连续一周的观察记录,样品1浸泡过的细胞培养液内细胞生长状态佳细胞数目多.且其对呼吸道合胞病毒(RSV)有显著地吸附效果.结论 木鱼石对细胞生长有促进作用,且有抗RSV效果.
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利用RNA干扰机制抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒的增殖
本文探讨依靠RNAi技术对猪繁殖与呼吸综合征病毒( PRRSV) 增殖的干扰作用.筛选到针对编码PRRS病毒核衣壳蛋白的N基因的两处靶序列作为候选片段,在MARC-145细胞上进行基因干扰实验研究.成功观测到由载体表达的小干扰RNA (siRNA)在MARC-145细胞中对PRRS病毒增殖的抑制现象.通过选取不同时间段对病毒进行TCID50检测,以及对CPE出现时间进行观察和免疫荧光技术,得到RNA干扰对PRRS病毒增殖抑制作用的动态数据.证实在真核细胞水平上,RNA干扰机制可以抑制PRRS病毒的增殖.实验结果表明,依靠载体表达的RNA干扰技术将会对今后针对PRRS病毒的新型疫苗开发提供一个新思路.
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应用TCID50法比较4种细胞对呼吸道腺病毒的敏感性
目的 建立腺病毒滴度测定的TCID50方法,并比较MDCK、Vero、HEp-2及A549 4种细胞对人呼吸道腺病毒的敏感性.方法 将腺病毒作连续10倍稀释,每个稀释度取100μl加入96孔细胞培养板中,随后加入消化的宿主细胞100μl,每个稀释度作10个重复,并设空白细胞培养对照.置37℃,5％CO2培养箱中.逐日观察细胞病变,并记录细胞病变孔数,直到对照细胞老化脱落为止,按Reed-Muench法计算病毒的TCID50.结果 呼吸道腺病毒可在MDCK、Vero、HEp-2及A549四种细胞中增殖,并出现典型细胞病变,在观察期内A549和Vero细胞能测出TCID50值.结论 四种细胞对腺病毒的敏感性依次为A549＞ Vero＞ Hep-2＞ MDCK.
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mBD1-mBD3融合基因真核表达载体构建及体外抗流感病毒初步研究
目的 构建小鼠β-防御素1和β-防御素3(mBD1,mBD3)融合基因的真核表达载体,研究mBD1-mBD3融合蛋白的抗流感病毒作用.方法 通过RT-PCR和重建PCR方法构建mBD1-mBD3融合基因;经EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切后插入相同酶切的pcDNA3.1(+),构建成重组质粒pcDNA3.1(+)/mBD1-mBD3,对重组质粒进行PCR、酶切和测序鉴定;将构建好的真核表达载体转染MDCK细胞,G418筛选稳定表达株,RT-PCR和免疫荧光染色法鉴定胞内mBD1-mBD3的表达.用流感病毒感染稳定表达细胞株,TCID50测定并分析抗流感病毒作用.结果 成功克隆到mBD1-mBD3基因,并构建了真核表达载体pcDNA3.1(+)/mBD1-mBD3.RT-PCR和间接免疫荧光证实重组质粒可以在细胞内表达.实验组的TCID50显著高于对照组,初步显示出mBD1-mBD3的抗流感病毒作用.结论 本研究成功构建了pcDNA3.1(+)/mBD1-mBD3真核表达载体,且能在MDCK细胞中稳定表达,表达产物具有一定的抗流感病毒作用.为进一步深入研究mBD1-mBD3的生物学特性及其抗流感病毒作用机制奠定了基础.
