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重组人促红细胞生成素的 HPLC 与 UPLC 肽图谱分析
目的 分析 rHuEPO 供试品及其对照品经胰酶酶解后分别在 HPLC 与 UPLC 上的肽图谱表现.方法 rHuEPO 供试品及对照品经透析、冻干、重新溶解和胰酶酶切后,以三氟醋酸/水,三氟醋酸/乙腈/水作为流动相梯度洗脱,分别以 HPLC 及 UPLC 连接反相色谱柱分析酶切后的肽段.结果 rHuEPO 供试品及其对照品经胰酶酶切后的肽段在 HPLC 上肽图谱表现一致,在 UPLC 上肽图谱也完全一致.UPLC 分析 rHuEPO 肽图需要的进样量更少,且较传统 HPLC 的分析时间大为缩短,同时不损失分离度及灵敏度.结论 UPLC 与 HPLC 均能验证 rHuEPO 供试品及对照品肽图的一致性,相比于 HPLC、UPLC 分析肽图谱更方便快捷,更节省样品,更适合分析 rHuEPO 肽图.
关键词： 重组人促红细胞生成素 胰酶酶解 肽图谱 高效液相色谱 超高效液相色谱 -
液质联用(LC/MS)技术在单克隆抗体(曲妥珠单抗)结构表征上的应用
目的:应用LC/MS(液质联用)和LC/MSE方法(液相色谱/非数据依赖二级质谱数据采集方法,等频率切换高与低碰撞能量进行质谱数据扫描)对单克隆抗体(曲妥珠单抗,人源化单克隆免疫球蛋白IgGl)的结构进行深度表征.方法:先用LC/MS对曲妥珠单抗完整蛋白及其亚基(轻链和重链)的相对分子质量进行测定;然后用多种酶(胰蛋白酶和AspN)酶解蛋白并用LC/MSE肽图分析法对曲妥珠单抗的氨基酸全序列进行解析和确定,同时对可能发生的翻译后修饰(PTMs)进行定性和定量分析.再通过PNGase F酶来释放抗体上的糖链并应用LC/FLR/MS(液相色谱荧光检测与质谱联用)方法对其糖基化修饰进行结构分析及确认.结果:对曲妥珠单抗的完整蛋白及其亚基(轻链和重链)的相对分子质量测定得到良好的质量准确度,由此可判定特定蛋白修饰在轻链和重链上的分布.通过对曲妥珠单抗酶解后的氨基酸全序列确认,可对其翻译后修饰以及可能的错误氨基酸序列进行解析.该抗体肽图分析的氨基酸序列覆盖率是100％.糖基化分析是通过对游离的N-链接寡糖进行2-AB荧光标记后再用LC/FLR/MS(液相色谱荧光检测与质谱联用)方法来进行的.联合使用这些分析方法,能够有效地对不同批号和不同工艺的抗体药物进行常规质量检测和深度表征,控制药物质量,为患者提供安全可靠的生物治疗药品.结论:结合液质联用(LC/MS和LC/MSE)技术,通过完整蛋白相对分子质量的测量,肽图分析测定氨基酸序列以及翻译后修饰的定性和定量分析,结合游离N-链接寡糖的分析表征,对单克隆抗体曲妥珠单抗进行了全面的结构表征,并建立了一套单克隆抗体结构表征的平台化方案.
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聚乙二醇化学修饰超氧化物歧化酶的研究进展
超氧化物歧化酶(SOD)是生物体内重要的自由基清除剂,主要催化超氧阴离子(O2-)的歧化反应,能缓解许多由自由基介导的炎症反应,减轻组织缺血性损伤,预防和治疗辐射损伤.在临床上SOD主要用于延缓人体衰老,防止色素沉着,消除局部炎症,特别是治疗风湿性关节炎、慢性多发性关节炎及辐射防护.但半衰期短、稳定性差、免疫原性等因素限制了SOD的临床应用.
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乙型肝炎患者HBsAg携带者血清中多肽图谱的研究
本文建立了自少量血清中研究I-IBsAg多肽图谱的方法,患者血清经纯化、SD.S聚丙烯酰胺凝胶电泳及Western吸印后,HBgAg多肽用酶免疫染色或放射自显影进行分析,发现10例慢性乙肝患者血清HBsAg多肽组成有明显差别.同一来源的HBV毒株在不同个体或同一个体随病程不同多肽图谱亦不同.血清HBV DNA阳性与多肽P39/P42的关系较P31/P34为密切,提示Pre-S1抗原不仅在急性感染中与病毒复制有关,在慢性感染中亦有关,PHSA'受体与P31/P42的符合率为94.1%,反映这一多肽确带有PHSA受体.
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重组人甲状旁腺素1-34胰蛋白酶切肽图谱分析
目的:对重组人甲状旁腺素1-34进行肽图谱测定,以确证一级结构和比较不同批产品间一级结构的一致性.方法:运用梯度洗脱/反相高效液相色谱法对样品进行纯度检查和肽图谱测定.结果:建立了重组人甲状旁腺素1-34的胰蛋白酶水解肽图谱HPLC测定方法,3批样品的肽图谱均与对照品一致.结论:建立的肽图测定方法简便、准确、重现性好,适用于产品的质量控制.
关键词： 重组人甲状旁腺素1-34 肽图谱 胰蛋白酶切 高效液相色谱法 一级结构 -
RP-HPLC法分析重组人胰高血糖素类多肽-1(7-36)肽图谱
目的:建立重组人胰高血糖素类多肽-1(7-36)[rhGLP-1(7-36)]胰蛋白酶或V8蛋白酶肽图分析方法.方法:酶解缓冲液分别为1%碳酸氢铵缓冲液(pH 7.8)和磷酸盐缓冲液(pH 7.8),酶与底物的比例为1:10,酶解时间分别为3 h和6h.采用ODS柱(250 mm ×4.6mm,5 μm),以三氟醋酸-水(0.1:100)为流动相A,三氟醋酸-水-乙腈(0.1:5:95)为流动相B.胰蛋白酶洗脱梯度:0-30 min,流动相A与B的比例为80:20→55:45.V8蛋白酶洗脱梯度:0-8 min,流动相A与B的比例为99:1→95:5;8-55 min,比例为95:5→48:52.流速:1.0 mL·min-1,检测波长214 nm,柱温:37℃.结果:无论用胰蛋白酶或V8蛋白酶酶解rhGLP-1(7-36),控制好酶与底物的比例及酶解的时间,都可以得到重现性好的稳定的肽图.结论:本方法可用于重组人胰高血糖素类多肽-1(7-36)胰蛋白酶和V8蛋白酶肽图分析,简便,可行.
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重组人胰岛素类似物的HPLC分析
目的:探讨HPLC分析在重组人胰岛素类似物鉴别和杂质检测中的适用性.方法:采用反相色谱柱(C18),以硫酸钠-磷酸缓冲液( 0.2 mol·L-1,pH 2.3)和乙腈为流动相,流速0.8或1.0 mL·min-1,柱温40 ℃,检测波长214 nm;用分子筛柱(Zorbax GF250)以磷酸铵缓冲液(0.1 mol·L -1,pH 7.5)和乙腈为流动相,流速0.5 mL·min-1,检测波长214 nm;检测重组人胰岛素类似物及其酶解片段.结果:获得胰岛素及其类似物的RP-HP LC图谱,肽图谱和高效体积排阻色谱(HPSEC)图.结论:本文方法能够有效地区别和检测胰岛素类似物及有关物质,为该类药物的质控提供了科学依据.
