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体外电刺激诱导大鼠骨髓间充质干细胞心肌特异性标志物MEF-2C和Cx43的表达
骨髓间充质干细胞(BMSCs)由于具有向心肌方向分化的潜能,目前已成为一种新的能够修复心脏组织损伤的重要治疗选择.在本实验中我们探讨了体外不同的电刺激时间对BMSCs向心肌方向分化的影响.实验共分为三组:①电刺激组,完全培养基培养的大鼠骨髓间充质干细胞(rBMSCs)受到电压为2V,频率为2 Hz,脉宽为5ms的电刺激,作用时间为30min/d、2h/d、4 h/d、6 h/d,连续作用10 d;②5-氮胞苷(5-Aza)组,5-Aza(10 μmol/L)诱导rBMSCs 24 h,然后采用完全培养基培养10 d;③空白对照组,完全培养基静态培养rBMSCs 10 d.通过实时荧光定量PCR方法检测各组rBMSCs的肌细胞特异性增强因子-2C(MEF-2C)mRNA和缝隙连接蛋白43 (Cx43)mRNA的表达;通过Western blot方法检测各组rBMSCs的MEF-2C蛋白和Cx43蛋白的表达.实验结果显示:不同持续时间的电刺激组及5-Aza组的MEF-2C mRNA、Cx43 mRNA表达量及MEF-2C蛋白、Cx43蛋白表达量均明显高于空白对照组(P＜0.05).本实验结果提示,体外电刺激可以诱导rBMSCs向心肌方向分化,其中2 h/d作用效果佳,但其机制尚未明确.
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脂多糖对破骨细胞生成及骨吸收功能作用及其机制研究
目的 探讨脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)对破骨细胞生成及其骨吸收功能的作用及机制.方法 取雄性C57BL/6小鼠股骨及胫骨骨髓,分离培养骨髓源巨噬细胞(bone marrow-derived macrophages, BMMs),并行流式细胞仪鉴定.取BMMs采用不同浓度LPS(0、100、200、500、1 000、2 000 ng/mL)培养后,以细胞计数试剂盒8(cell counting kit 8,CCK-8)检测不同浓度LPS对细胞活性影响.为探讨LPS对破骨细胞生成的影响,取BMMs分为巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor,M-CSF)组、M-CSF+核因子 κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor κB ligand,RANKL)组、M-CSF+RANKL+50 ng/mL LPS组、MCSF+RANKL+100 ng/mL LPS组,对应培养后行抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase,TRAP)染色观察,计算破骨细胞面积百分比.为探讨LPS对Connexin43蛋白及基因表达影响,将BMMs分别分为对照组(M-CSF+RANKL)、LPS组(M-CSF+RANKL+100 ng/mL LPS)以及对照组(M-CSF+RANKL)、50 ng/mL LPS组(MCSF+RANKL+50 ng/mL LPS)、100 ng/mL LPS组(M-CSF+RANKL+100 ng/mL LPS)培养后,行Western blot以及实时荧光定量PCR检测.为探讨LPS对破骨细胞骨吸收能力的影响,将BMMs分为M-CSF组、M-CSF+RANKL组、M-CSF+RANKL+50 ng/mL LPS组、M-CSF+RANKL+100 ng/mL LPS组对应培养后,采用骨吸收实验检测骨吸收面积百分比.结果 流式细胞仪鉴定培养细胞为BMMs.CCK-8法检测显示与其他浓度相比,100 ng/mL LPS明显促进BMMs活性(P<0.05).TRAP染色示,M-CSF组未见破骨细胞生成;与M-CSF+RANKL组相比,MCSF+RANKL+50 ng/mL LPS组、M-CSF+RANKL+100 ng/mL LPS组破骨细胞体积更大、细胞核更多,其中后者显著,3组破骨细胞面积百分比差异均有统计学意义(P<0.05).Western blot检测,LPS组Connexin43蛋白相对表达量较对照组明显提高(P<0.05);实时荧光定量PCR检测示,对照组、50 ng/mL LPS组以及100 ng/mL LPS组Connexin43基因相对表达量逐渐增加,比较差异有统计学意义(P<0.05).骨吸收实验示,M-CSF组未形成破骨细胞骨吸收;M-CSF+RANKL组、M-CSF+RANKL+50 ng/mL LPS组、M-CSF+RANKL+100 ng/mL LPS组骨吸收面积百分比逐渐增加,比较差异均有统计学意义(P<0.05).结论 100 ng/mL LPS能够促进Connexin43的表达,从而使破骨细胞生成增多,骨吸收功能加强.
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SRC激酶在人乳腺癌细胞对阿霉素耐药及侵袭转移中的作用
目的 探讨SRC激酶抑制剂PP2在乳腺癌细胞对阿霉素(adriamycin,ADM)耐药及侵袭转移过程中的作用.方法 采用MTT法检测不同浓度ADM对乳腺癌细胞敏感株(MCF-7)和耐药株(MCF-7/ADM)细胞的增殖抑制作用,计算半数抑制浓度(50％ inhibitory concentration,IC50)及耐药指数(resistance index,RI);Western blot检测MCF-7和MCF-7/ADM细胞内多药耐药蛋白MDR1、SRC及缝隙连接蛋白43(Cx43)蛋白表达;Transwell和细胞划痕实验检测MCF-7、MCF-7/ADM细胞、不同浓度PP2(1、2、4 μmol/L)预处理MCF-7/ADM24 h细胞的侵袭和迁移能力;采用标准集落形成分析法观察4μmol/L PP2预处理对ADM细胞毒性的影响.结果 ADM对MCF-7的增殖抑制作用大于MCF-7/ADM细胞(P＜0.01);ADM对MCF-7细胞IC50为24.55 μmol/L,对MCF-7/ADM细胞IC50为770.57μmol/L,RI为31;与MCF-7细胞比较,MCF-7/ADM细胞MDR1、SRC蛋白表达增高(P＜0.01),且MCF-7/ADM细胞具有更强的侵袭迁移能力(P＜0.01),采用SRC抑制剂后,MCF-7/ADM细胞侵袭转移能力被抑制(P＜0.01),细胞集落形成率下降,即对ADM的敏感性提高(P＜0.01).结论 人乳腺癌细胞MCF-7在对ADM耐药的过程中伴随着SRC蛋白表达增多,SRC抑制剂可以降低细胞耐药性以及侵袭转移能力.
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瘦素对小鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用及表达Cx43的影响
目的 探讨瘦素对局灶性脑缺血再灌注损伤大脑缝隙连接蛋白43(Cx43)表达的影响及瘦素的脑保护作用机制.方法 将45只健康雄性昆明小鼠随机分为假手术组、模型组和瘦素组.模型组和瘦素组制备小鼠大脑中动脉局灶性脑栓塞模型,瘦素组于缺血0 min时腹腔注射1 mg/kg瘦素,缺血2h再灌注24 h后评价神经功能状态,脑组织TTC染色测定脑梗死体积,HE染色观察组织病理学改变；原代培养SD乳鼠的大脑皮层星形胶质细胞(Ast),将纯化后的Ast分为对照组、模型组、瘦素100 μg/L组和瘦素500 μg/L组,制作大鼠大脑皮质星形胶质细胞缺氧复氧模型,MTT法检测星形胶质细胞存活率,Western blot方法检测脑组织及星形胶质细胞中Cx43的表达变化.结果 与模型组相比,瘦素组神经功能损伤状态得到改善(P＜0.05),脑缺血再灌注后脑梗死体积缩小(P＜0.05),脑组织病理学损伤程度减轻,Cx43的表达明显降低(P＜0.01)；与模型组比较,瘦素100 μg/L组Ast存活率提高,Cx43表达减少,但差异均无统计学意义(P＞0.05),瘦素500 μg/L组Ast存活率显著提高(P＜0.01),Cx43表达明显减少(P＜0.01).结论 体内和体外实验均提示,瘦素可能通过降低损伤后脑组织中Cx43的表达,减轻脑缺血再灌注损伤.
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兔早期心肌缺血Connexin 43的变化
目的探讨早期急性心肌缺血缝隙连接蛋白43(Cx43)的变化.方法结扎兔左冠状动脉造成急性心肌缺血模型,于结扎后30 min取左心室前壁心肌,用免疫组织化学法和免疫电镜胶体金法观察、定位心肌缺血Cx43的分布,半定量统计分析.结果急性心肌缺血(30 min),免疫组化图像分析系统分析结果显示Cx43阳性面积减少约40%;免疫电镜显示胶体金颗粒明显减少,分布未见改变.结论兔急性心肌缺血早期Cx43有明显减少.
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兔心力衰竭时跨室壁复极离散度和缝隙连接蛋白43变化的研究
目的:探讨阿霉素诱导的兔心力衰竭(heart failure,HF)时跨室壁离散度和缝隙连接蛋白43的变化.方法:将18只日本大耳白兔随机分为对照组(n=10)及模型组(n=8).采用阿霉素诱导建立兔HF模型.采用单相动作电位(monophasic action potential,MAP)记录技术,分别记录HF组和对照组左室心肌内、中、外膜的MAP,分别测量获得20列三层心室肌的90％动作电位时程(monophasic action potential duration,MAPD90),计算并分析跨室壁复极离散度(transmural dispersity of repolarization,TDR)的变化,TDR为每列中MAPD90max与MAPD90min的差值.应用免疫荧光染色法检测缝隙连接蛋白43(gap junction connexin43,CX43)在心肌细胞间分布的变化.结果:与对照组比较HF组的MAPD90缩短,TDR则明显增大(P＜0.05).免疫荧光染色法检测显示,HF组CX43分布与对照组有所差别.结论:HF组心脏TDR增加,CX43分布发生改变,其可能与HF时恶性心律失常的发生有关.
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血管紧张素Ⅱ对心肌缝隙连接蛋白43重构的影响及贝那普利的干预作用
目的 采用大鼠肾上腹主动脉部分结扎的模型,观察心肌缝隙连接蛋白(Connexin,Cx)43含量和分布的变化以及贝那普利干预的防治效果.方法 将30只雄性Wismr大鼠随机等分为对照组(A组)、腹主动脉结扎组(B组)、结扎+贝那普利组(C组).喂养8周后处死,用放射免疫法测定血浆血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)浓度和心肌组织AngⅡ浓度,用免疫组化方法显示大鼠心肌Cx43的分布特征,半定量统计分析.结果 与A组相比,B组大鼠血浆、心肌AngⅡ浓度显著升高(均P＜0.01),但B组大鼠心房肌及心室肌Cx43含量均较A组显著减少(分别为P＜0.05和P＜0.01),且分布紊乱;而C组Cx43含量较B组显著增多(P＜0.01),且分布不规律程度减轻.结论 AngⅡ升高可能导致心肌Cx43重新分布及表达减少;贝那普利能有效减轻Cx43的重构.
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Cx43连接蛋白与心脏发育
缝隙连接蛋白43(Cx43)是哺乳动物心脏中主要的连接蛋白,研究表明其对心脏的正常分化和发育发挥着重要作用.Cx43的表达异常可引起多种心血管疾病以及心脏先天性畸形的发生.本文就Cx43的结构、表达及其与心脏发育的新研究进展予以综述.
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内皮素-1及缝隙连接蛋白43在心律失常发生中的作用
近几年研究表明,内皮素-1(ET-1)和缝隙连接蛋白43(Cx43)与心律失常的发生有密切关系.ET-1的受体或Cx43可能是预防心律失常发生的新的药理学靶点.本文就ET-1和Cx43与心律失常关系的研究进展作一综述.
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缝隙连接蛋白43与创伤后脑水肿相关性研究
目的 探讨缝隙连接蛋白43(Cx43)与创伤后脑水肿的相关性.方法 大鼠脑损伤前2h经侧脑室注射Cx43特异性阻断剂反义寡核苷酸(ODNs)或生理盐水,用Feeney's自由落体法制作局灶性脑损伤动物模型,通过星形胶质细胞的特异性标记物-胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫荧光染色,观察脑皮质区星形胶质细胞的形态、数量的变化,同时观察脑组织的水肿情况.结果 脑损伤后生理盐水对照组GFAP标记的星形胶质细胞数量较ODNs预处理组明显增多(P<0.05),细胞胞体较肥大;ODNs预处理组脑水肿较生理盐水对照组明显减轻(P<0.05).结论 阻断Cx43可减轻脑创伤后脑水肿的程度,Cx43参与了脑损伤后的脑水肿的形成.
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阿托伐他汀对氧化低密度脂蛋白诱导的A7r5细胞增殖及Cx43蛋白的影响
目的 探讨阿托伐他汀对氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)诱导大鼠胸大动脉平滑肌细胞(A7r5)增殖及缝隙连接蛋白43(Cx43)表达的影响.方法 培养A7r5细胞株,将细胞分4组:对照组,Ox-LDL组,Ox-LDL+二甲基亚砜(DMSO)组及Ox-LDL+他汀组.MTS法细胞毒试验及流式细胞术检测细胞周期,从而检测A7r5的增殖活性;流式细胞术检测各组供体细胞Q3(发绿色荧光)与受体细胞Q4(双阴性)比值(Q3/Q4)的变化,从而分析GJ功能的变化;Western blot法检测A7r5细胞中Cx43表达.结果 与对照组相比,Ox-LDL组及Ox-LDL+DMSO组A7r5细胞的增殖活性增加,S期细胞比率增高(P＜0.05);与Ox-LDL组及Ox-LDL+DMSO组比较,Ox-LDL+他汀组二者均降低(P＜0.05).与对照组相比较,Ox-LDL组及Ox-LDL+DMSO组A7r5细胞的Q3/Q4比值增大,提示缝隙连接功能增强(P＜0.05);与Ox-LDL组及Ox-LDL+DMSO组比较,Ox-LDL+他汀组Q3/Q4比值减小,缝隙连接功能显著降低(P＜0.05).与对照组相比,Ox-LDL组和OxLDL+DMSO组A7r5细胞的Cx43表达增多(P＜0.05);与OxLDL组及Ox-LDL+DMSO组比较,OxLDL+他汀组Cx43表达减少(P＜0.05).结论 阿托伐他汀可以抑制氧化低密度脂蛋白诱导的A7r5细胞增殖及Cx43蛋白的表达.
关键词： 阿托伐他汀 大鼠胸大动脉平滑肌细胞 细胞增殖 缝隙连接蛋白43 -
MEGJ调节缺氧后血管平滑肌细胞低反应性的cAMP-PKA机制
目的 观察肌内皮缝隙连接(MEGJ)参与血管生成素-2(Ang2)调节缺氧血管平滑肌细胞(VSMCs)中诱导型一氧化氮合酶(iNOS)高表达和血管低反应性的机制,探讨其是否与cAMP-PKA途径有关.方法 采用大鼠血管内皮细胞(VECs)和VSMCs双面共培养模型,分别采用western blotting、phalloidin荧光法和染料Sulforhodamine B转运技术,观察缝隙连接蛋白43(CX43)亚型表达、MEGJ形成及通讯功能,同时检测VSMCs中iNOS表达,并利用FITC-BSA荧光透过率反映VSMCs收缩反应性.结果 在双面共培养模型中,PKA抑制剂H-89可削弱外源性Ang2作用下缺氧VSMCs的iNOS表达和VSMC收缩反应性(P<0.05);缺氧后VECs中cAMP浓度,以及PKA活性显著增高(P<0.05),其增高可被Ang2进一步增强,而被Tie2的SiRNA削弱(P<0.05).在双面共培养系统上腔(VECs面)给予cAMP和PKA抑制剂,均可显著抑制外源性Ang2作用下缺氧后增高的MEGJ中Cx43蛋白表达、MEGJ形成和通讯功能(P<0.05).结论 缺氧使VSMCs中iNOS表达增高和收缩性降低,是通过cAMP-PKA信号途径上调Cx43蛋白表达、MEGJ形成和通讯功能而实现的.
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心肌缝隙连接蛋白43在缺血再灌注损伤模型中的表达水平及变化的研究
目的 观察自噬在心肌缺血再灌注损伤(MI/RI)中,对心室肌缝隙连接蛋白43(Cx43)及其磷酸化(p-Cx43)状态的影响.方法 将24只雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为假手术组(SH组)、氯喹+假手术组(CQ+SH组)、手术组(I/R组)、氯喹+手术组(CQ+I/R组).采用可逆性冠状动脉左前降支结扎缺血30min、再灌注2h制作MI/RI模型.TTC和Evans blue双染检测心肌梗死面积;Western bolt法测定Cx43、p-Cx43的含量.结果 与假手术组比较,手术组大鼠心肌梗死明显,p-Cx43含量显著下调,与手术组比较,CQ+I/R组p-Cx43表达水平上调.结果心肌缺血再灌注损伤中,干预自噬可改善Cx43磷酸化水平.
