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荧光定量PCR探针熔解曲线法在结核分枝杆菌耐药基因检测中的应用
目的 应用荧光定量PCR探针熔解曲线法检测耐多药结核病患者的临床分离菌株对一线抗结核药物的耐药基因突变.方法 于2009年1月1日至2012年12月31日留取南京市胸科医院结核科门诊部或住院的所有肺结核患者痰液标本,每人3～5 ml,均进行痰结核分枝杆菌培养、鉴定和药物敏感性试验(简称“药敏试验”),分离出结核分枝杆菌菌株67株.应用荧光定量PCR探针熔解曲线法,根据靶序列熔点变化,实时PCR检测结核病患者的临床分离标本对利福平、异烟肼、乙胺丁醇及链霉素的耐药情况;通过与传统药敏试验进行对比,对2种结果不一致的菌株进行基因测序分析,探讨其发生突变的位点差异,并观察在治疗中的变化.结果 利福平和异烟肼的表型和基因型检测具有较高的一致性,分别为99％(66/67)和97％(65/67),不一致的菌株都是表型检测法为耐药,而基因型检测为敏感,测序未检测到突变.乙胺丁醇和链霉素的表型和基因型检测一致性较低,分别为60％(40/67)和75％(50/67).测序发现,乙胺丁醇的突变发生在embB306和embB406位点上;链霉素突变发生在rrs基因517位点和907位点,以及rpsL43耐药密码子.结论 应用荧光定量PCR探针熔解曲线法,能快速筛查结核分枝杆菌对一线抗结核药物的耐药情况.
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多色探针熔解曲线法在卡马西平不良反应相关基因检测中的临床评价
目的 对多色探针熔解曲线法(multicolor melting curve analysis,MMCA)用于卡马西平不良反应相关的HLA-B *15.:02基因检测进行临床评价.方法 收集厦门市中心血站1 147份厦门地区无偿献血者的外周静脉血样本,经基因DNA提取后,按双盲对照试验,分别应用MMCA法和HLA-SBT测序法对各样本进行HLA-B*15:02基因检测,比较2种检测方法的符合率.对于检测结果不一致的标本,采用第三方Sanger测序和电泳验证,计算总符合率.结果 采用MMCA法共检出77份HLA-B*15:02阳性标本,1 070份HLA-B*15:02阴性标本.采用HLA-SBT测序法共检出74份HLA-B*15:02阳性标本,1 070份HLA-B*15:02阴性标本,以及3份无明确的分型信息的标本(仅显示为B*15:VG-B*15:CYS型).该3份标本经Sanger测序以及电泳验证,确认为HLA-B*15:02阳性标本.因此,MMCA法检测HLA-B*15:02基因的阳性检出率为100％(77/77),阴性检出率为100％(1 070/1 070),总符合率为100％(1 147/1 147).此外,在l 147份临床标本中共检出77份阳性结果,HLA-B*15:02的携带率为6.7％(77/1147),这与文献报道的数裾基本一致.结论 MMCA法用于HLA-B*15:02基因的检测,具有简便、快速、灵敏度高、特异性强等优点,可应用于卡马西平不良反应相关的HLA-B *15:02基因的临床辅助检测.
关键词： 卡马西平 基因检测 探针熔解曲线法 HLA-B*15:02 不良反应 -
探针熔解曲线法快速检测结核分枝杆菌注射类二线药耐药突变
目的 评价结核分枝杆菌注射类二线药耐药突变检测试剂盒MehPro TB/SL的分析性能以及临床性能.方法 首先使用企业参考品对试剂盒的突变检出能力进行考察,之后将野生型基因组DNA以10倍梯度稀释后考察试剂盒的低检测限,使用野生型质粒以及含常见耐药突变的质粒以不同突变比例混合考察试剂盒检测不均一耐药样本的能力,并使用23株非结核分枝杆菌标准株考察试剂盒的分析特异性,后使用241份临床分离株对试剂盒进行临床评价.结果 该试剂盒可以将9种耐药相关突变与1种野生型多态性与野生型进行区分.可以检测到低至5个拷贝的野生型基因组DNA.当突变比例为30％或更高时,试剂盒可以将其与野生型进行区分.23种非结核分枝杆菌的结果显示该试剂盒有良好的特异性.和比例法药敏试验进行对比,该试剂盒的临床灵敏度为卡那霉素90.0％(9/10),阿米卡星80.0％(8/10),卷曲霉素85.7％(6/7);特异性为卡那霉素98.8％(85/86),阿米卡星98.8％(85/86),卷曲霉素96.6％(86/89).试剂盒检测结果与测序结果一致.结论 该试剂盒灵敏度高、特异性好,可以快速、准确地检测结核分枝杆菌注射类二线药常见的耐药突变,有望应用于临床.
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结核分枝杆菌对氟喹诺酮类药物敏感性的实验研究
目的 获得四种氟喹诺酮(FQ)对结核分枝杆菌的小抑菌浓度(MIC),评价PCR探针熔解曲线法(PMAA)检测结核分枝杆菌对氟喹诺酮药物耐药性的临床价值.方法 124例对氧氟沙星敏感的菌株和78例对氧氟沙星耐药的菌株,在96孔细菌培养板中,用Middlebrook 7H9液体培养基将药物进行连续倍比稀释后,加入5×10-2 mg/ml菌液100 μl,用刃天青显色法测定MIC;并用PCR探针熔解曲线法(PMAA)检测结核分枝杆菌对氟喹诺酮(FQ)药物的耐药突变.结果 氧氟沙星折点浓度为2 μg/ml,加替沙星和莫西沙星对结核分枝杆菌的MIC90比氧氟沙星和左氧氟沙星要低4～8倍,具有比氧氟沙星和左氧氟沙星更好的抗结核分枝杆菌的活性.以罗氏比例法为金标准,PCR-PMAA检测敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和符合率分别为96.2％,97.6％,96.2％,97.6％和97.0％.结论 利用微量MIC方法较常规药敏方法可以获得更多的耐药信息.用PCR-PMAA法能高效快速的检出耐药突变菌株.两种方法结合应用,对临床肺结核疾病早期用药具有更好的指导价值.
